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    TLR4與NF-κB蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2014-08-31 01:30:12高勝利徐亮亮龐作良
    實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志 2014年9期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞因子分化肺癌

    高勝利,徐亮亮,龐作良

    (新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 胸外科,新疆 烏魯木齊,830011)

    目前,肺癌已成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,而肺部的不正常炎性過程可能與肺癌的發(fā)生及發(fā)展具有一定相關(guān)性。Toll樣受體4(TLR4)是與炎癥、腫瘤關(guān)系最為密切的TLR家族成員之一,也是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子,是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[1]。TLR為單個高度保守Ⅰ型跨膜非催化性蛋白質(zhì),當(dāng)微生物突破機(jī)體皮膚、黏膜等物理屏障時,其可識別微生物本身所具有的保守性微結(jié)構(gòu),并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。TLR誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和腫瘤主要是通過MyD88的依賴性途徑及核因子κB信號途徑來啟動細(xì)胞活化進(jìn)程,調(diào)控樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟和免疫正向調(diào)節(jié)分子的表達(dá)[2]。由于腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可產(chǎn)生一些能被TLR識別的內(nèi)源性配體,因此TLR在腫瘤免疫監(jiān)視中可能發(fā)揮了一定作用。

    核因子-κB(NF-κB)是具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控多種基因(免疫、炎癥反應(yīng)、病毒和原癌基因)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而激活的NF-κB參與癌癥的啟動、發(fā)生及發(fā)展過程,在炎癥性相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈高表達(dá),且在炎癥與癌變間起橋梁作用[3]。本研究采用免疫組化SP法分析非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中TLR4與NF-κB蛋白水平的表達(dá),并探討其在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制及與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    收集2007年1月—2010年12月在本院行完全性手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的NSCLC標(biāo)本58例,所有患者術(shù)前均未接受放療或化療,癌旁組織距離癌組織邊緣5 cm以上,且病理證實(shí)為正常肺組織。其中男47例,女11例;年齡45~76歲,中位年齡66.5歲;吸煙指數(shù)>400支/年36例,<400支/年22例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例。術(shù)后病理分期按2007年世界衛(wèi)生組織(WHO)國際抗癌聯(lián)盟制定的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn),并參考《外科診斷病理學(xué)》進(jìn)行命名及分類,其中腺癌31例,鱗癌26例,腺鱗癌1例;高分化癌15例,中分化癌31例,低分化癌和未分化癌12例。根據(jù)2009年國際肺癌研究學(xué)會(IASLC)第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn): Ⅰ期15例,Ⅱ期22例,Ⅲ期21例。

    1.2 方法

    1.2.1 主要試劑:兔抗人TLR4多克隆抗體購自上海研卉生物科技有限公司,兔抗人NF-κB多克隆抗體購自天津津脈公司,SP免疫組化試劑盒購自北京中杉公司。

    1.2.2 試驗(yàn)方法:采用免疫組化SP法,染色程序嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。用已知TLR4和NF-κB陽性切片作陽性對照,用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作空白對照。經(jīng)DAB顯色、復(fù)染、脫水,中性樹膠封片后編號,常規(guī)脫蠟、水化的組織切片按WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)由病理科同一組醫(yī)師進(jìn)行診斷和病理分級。

    1.3 評定標(biāo)準(zhǔn)

    TLR4在NSCLC癌組織和癌旁組織中均以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽性。NF-κB在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)主要表現(xiàn)為胞漿或細(xì)胞核中有棕褐色或棕黃色顆粒沉淀。染色強(qiáng)度分為(-)級:著色區(qū)內(nèi)無棕黃色顆粒或呈均勻一致淡黃色,與背景一致; (+)級:著色區(qū)內(nèi)可見少量淡黃色顆粒,明顯高于背景或細(xì)胞質(zhì)內(nèi),可見較多深棕色顆粒; (2+)級:著色區(qū)內(nèi)可見大量深棕色顆粒。

    2 結(jié) 果

    2.1 NSCLC組織和癌旁組織中TLR4及NF-κB蛋白表達(dá)

    TLR4和NF-κB蛋白在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率(60.3%和67.2%)明顯高于癌旁正常肺組織中的陽性表達(dá)率(15.5%和8.6%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。

    表1 TLR4和NF-κB蛋白在NSCLC組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)[n(%)]

    2.2 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

    在NSCLC低、中、高分化組織中TLR4蛋白陽性表達(dá)率分別為83.3%、67.7%和26.7%,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。NSCLC不同組織學(xué)類型中NF-κB蛋白陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且在腺癌中的陽性率(80.6%)明顯高于鱗癌(51.9%)。見表2、圖1。

    表2 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

    圖1 NF-κB蛋白在NSCLC組織中的表達(dá) 400倍

    2.3 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

    39例NF-κB表達(dá)陽性的NSCLC標(biāo)本中有30例TLR4表達(dá)陽性。TLR4與NF-κB的相關(guān)系數(shù)r=0.486,提示NSCLC組織中TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)密切相關(guān),見表3。

    表3 NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

    3 討 論

    Medzhitov等[4]于1997年首次證明人類細(xì)胞表面存在TLR蛋白。目前,TLR4廣泛存在于人類細(xì)胞表面,且在多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)。有證明[5]研究,TLR4蛋白在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)。病原體的某些特異性成分與周圍分布的炎癥細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等)表面特異性模式識別受體相結(jié)合而發(fā)揮作用,即所謂的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs),通過產(chǎn)生大量細(xì)胞因子,可分泌炎癥因子,引起微環(huán)境改變,從而促使腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

    研究[6-8]發(fā)現(xiàn),TLR4誘導(dǎo)的信號通路在腫瘤形成過程中具有重要作用,并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Inoue等[9]研究證實(shí),機(jī)體在受到外來細(xì)菌或病毒感染時,TLRs開啟NF-κB信號通路,促使細(xì)胞因子產(chǎn)生,組建成腫瘤生長所需要的微環(huán)境,進(jìn)一步促使腫瘤啟動、繁殖。Chen等[10]也證明,TLR4作為一個信號通路啟動子,能激活NF-κB,刺激產(chǎn)生促炎癥反應(yīng)環(huán)境的形成,從而導(dǎo)致腫瘤生長和對化療藥物的耐藥性。Takahashi等[11]證實(shí),因長期肺組織損傷而誘發(fā)的炎癥可促進(jìn)肺癌的發(fā)生,提示應(yīng)用抗感染治療可預(yù)防或減緩肺癌的發(fā)病進(jìn)程??梢?,與炎癥相關(guān)的肺癌可能發(fā)病機(jī)制之一為腫瘤微環(huán)境中炎癥免疫被削弱和腫瘤免疫逃逸[12-13]。Fu等研究[14]發(fā)現(xiàn),NSCLC中TLR4表達(dá)明顯升高,與正常肺組織相比,TLR4表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,TLR4和NF-κB在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率分別為60.3%和67.2%,顯著高于癌旁正常肺組織(15.5%和8.6%),提示NSCLC組織中通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的異常表達(dá)而引起NF-κB表達(dá)增高,可能在NSCLC腫瘤逃逸和進(jìn)展中發(fā)揮作用。此外,在NSCLC低、中、高分化組織中TLR4蛋白陽性表達(dá)率分別為83.3%、67.7%和26.7%,兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示TLR4蛋白表達(dá)越高,NSCLC分化程度越低,TLR4表達(dá)增強(qiáng)者,癌組織分化程度越差,惡性程度越高,這與何鳳蓮等[15]結(jié)果一致。

    Bltimore于1986年發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,其存在于細(xì)胞核內(nèi)。研究[16]表明,被活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),而其充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子的作用是通過含κB序列結(jié)合位點(diǎn)且與多種基因啟動子區(qū)結(jié)合而發(fā)揮作用,多種決定細(xì)胞分化或凋亡的細(xì)胞因子被活化并發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)控細(xì)胞生長,調(diào)節(jié)多種黏附、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄而參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,NSCLC組織中TLR4蛋白表達(dá)與NF-κB蛋白表達(dá)密切相關(guān),說明通過TLR4激活NF-κB信號通路機(jī)制可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。此外,NF-κB在腺癌中的表達(dá)明顯高于鱗癌,提示NF-κB表達(dá)的高低對判定腫瘤的病理類型具有一定價值。

    總之,NSCLC組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)異常增高,明顯上調(diào),且兩者表達(dá)具有明顯相關(guān)性,提示通過TLR4/NF-κB信號通路可能誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而使肺癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長。

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