二甲雙胍對宮頸癌干細(xì)胞增殖及放化療敏感性的影響

郭倩 任倩梅 毛熙光 詹平

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，四川 瀘州 646000)

30%～50%的宮頸癌患者在治療結(jié)束后的3～5年內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，主要原因是放療和化療抵抗〔1，2〕。宮頸癌產(chǎn)生放療和化療抵抗的根源是宮頸癌干細(xì)胞的存在，宮頸癌干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因之一，也是腫瘤預(yù)后不良的重要因素〔3〕。宮頸癌干細(xì)胞是腫瘤組織中具備干細(xì)胞特性的極少量細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，并表達(dá)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其數(shù)量在手術(shù)及放化療后反而增多，出現(xiàn)富集現(xiàn)象〔4〕。Chhabra〔5〕的研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生放療抵抗的宮頸癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性，具有較強的裸鼠移植瘤形成能力和克隆形成能力，同時表達(dá)Oct4、CD24和CD44等腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物。Liu等〔6〕在探討宮頸癌放療抵抗機制時發(fā)現(xiàn)，放療誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)化是導(dǎo)致宮頸癌干細(xì)胞增多的重要原因。因此，提高宮頸癌干細(xì)胞放療敏感性的治療是改善宮頸癌愈后的關(guān)鍵措施。二甲雙胍是被廣泛應(yīng)用于臨床治療糖尿病的首選藥物〔7〕。服用二甲雙胍的糖尿病患者的腫瘤發(fā)病率低于應(yīng)用其他藥物治療糖尿病的患者〔8〕。二甲雙胍不僅對肝癌、腎癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌及宮頸癌細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用〔9，10〕，還對結(jié)腸癌干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、胃癌干細(xì)胞、胰腺癌干細(xì)胞、肝癌干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞及骨肉瘤干細(xì)胞的增殖具有抑制作用〔11〕。也有研究證實二甲雙胍不僅提高乳腺癌、食管癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、卵巢癌及肺癌的化療敏感性〔12〕，還能提高食管癌、結(jié)直腸癌、肺癌及胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性〔13〕。目前，尚未見到二甲雙胍對宮頸癌干細(xì)胞的增殖及放化療敏感性的相關(guān)報導(dǎo)。因此，本研究應(yīng)用常規(guī)方法從宮頸癌細(xì)胞中分選出宮頸癌干細(xì)胞，鑒定后進行體外培養(yǎng)，觀察二甲雙胍對宮頸癌干細(xì)胞增殖活性和放化療敏感性的影響，為提高治療宮頸癌的療效和改善患者愈后提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株，購買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.1.2主要試劑與儀器 二甲雙胍、順鉑、噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、二甲基亞砜(DMSO)、胰島素、碘化丙啶(Sigma-Aldrich公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、重組人表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子(Gibco公司)；CD24-FITC單克隆抗體、CD24同型對照、CD44-PE單克隆抗體、CD44同型對照(BD Pharmagen公司)；兔抗人CD133、Oct4、Nanog、性別決定基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Sox)-2、β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；Alexa Fluor?594標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Thermo公司)；Accutase?細(xì)胞消化液(嘉美生物技術(shù)公司)；超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、全自動酶標(biāo)儀(Thermo公司)；熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡(Olympus公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)槽、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；低溫細(xì)胞離心機(StatSpin公司)。

1.2實驗方法

1.2.1人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的培養(yǎng) 將裝有SiHa細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出，在37℃水浴箱中快速融化成液態(tài)，將復(fù)蘇的SiHa細(xì)胞以1×104個/ml的濃度接種到培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基5 ml，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，待大部分細(xì)胞貼壁后首次換液，培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞達(dá)到80%融合后，進行傳代。

1.2.2宮頸癌干細(xì)胞的分選 根據(jù)Chopra等〔14〕的方法，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選CD44+/CD24+SiHa細(xì)胞進行懸浮培養(yǎng)富集宮頸癌干細(xì)胞。方法如下：收集第3代處于對數(shù)生長期的Siha細(xì)胞，PBS洗滌后加入0.25%胰蛋白酶溶液進行消化，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，重懸細(xì)胞，以5×106個/ml的濃度接種到流式細(xì)胞檢測管中，隨后加入0.625 μl CD24-FITC單克隆抗體和CD44-PE單克隆抗體，同時設(shè)同型對照管，4℃避光孵育30 min，期間用一次性移液管吹打混勻3次，1 000 r/min離心5 min，用流式細(xì)胞術(shù)緩沖液重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上分選CD44+/CD24+SiHa細(xì)胞，使細(xì)胞純度>95%。將分選出的CD44+/CD24+SiHa細(xì)胞以1×106個/ml的濃度接種到培養(yǎng)皿中，用腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)基(1 ml DMEM/F12加入10 ng成纖維細(xì)胞生長因子、20 ng重組人表皮生長因子、25 mg胰島素和4 ml胎牛血清)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每日換液，7 d后細(xì)胞球形成，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，細(xì)胞球結(jié)構(gòu)變緊密后，按1∶3傳代，取第3代細(xì)胞球進行宮頸癌干細(xì)胞鑒定及實驗。

1.2.3宮頸癌干細(xì)胞的鑒定 參照Liu等〔15〕的方法，應(yīng)用免疫熒光染色法檢測干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和Oct4的表達(dá)。取第3代的腫瘤細(xì)胞球，用Accutase細(xì)胞消化液孵育3 min，制成單細(xì)胞懸液，以1×107個/ml的濃度接種于事先置于一次性6孔培養(yǎng)板各孔中的蓋玻片上，用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取出貼有細(xì)胞的蓋玻片，4%多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100透膜3 min，10%山羊血清封閉45 min，滴加兔抗人CD133、Oct4單克隆抗體，4℃避光孵育，12 h后滴加熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG，避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4二甲雙胍最佳作用濃度與時間的篩選 取第3代宮頸癌干細(xì)胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)，以DMSO為空白組，每孔內(nèi)細(xì)胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，去除未貼壁細(xì)胞后，分別加入終濃度為5、10、20 mmol/L的二甲雙胍溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，不同濃度和作用時間分別設(shè)6個復(fù)孔，在不同時間點取出培養(yǎng)板，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，避光孵育4 h，隨后每孔加入DMSO溶液150 μl，室溫混勻10 min，在酶標(biāo)儀上波長570 nm處檢測每孔的吸光度值(OD值)，根據(jù)公式：細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-對照組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%計算各組宮頸癌干細(xì)胞的存活率。

1.2.5順鉑最佳作用濃度的篩選 取第3代宮頸癌干細(xì)胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)，以DMSO為空白組，每孔內(nèi)細(xì)胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)同1.2.4。

周恩來和郭沫若此時正在武漢組織紀(jì)念抗戰(zhàn)一周年群眾歌詠大會，得知桂濤聲和冼星海創(chuàng)作了這首《在太行山上》，便前往冼星海住所先睹為快。

1.2.6放療最佳作用劑量的篩選 取第3代宮頸癌干細(xì)胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)，以DMSO為空白組，每孔內(nèi)細(xì)胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，去除未貼壁細(xì)胞后，分別用2、4、8、16 Gy的60-鈷γ射線照射24、48、72 h，不同劑量和作用時間分別設(shè)6個復(fù)孔，在不同時間點取出培養(yǎng)板，后續(xù)培養(yǎng)同1.2.4。

1.2.7實驗分組與細(xì)胞干預(yù) 取第3代宮頸癌干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分別接種于不同培養(yǎng)瓶中，隨機分為6組：①對照組：不做任何處理的宮頸癌干細(xì)胞；②二甲雙胍組：用20 mmol/L二甲雙胍處理細(xì)胞72 h；③放療組：用8 Gy的60-鈷γ射線照射72 h；④二甲雙胍+放療組：用20 mmol/L二甲雙胍處理細(xì)胞的同時用8 Gy的60-鈷γ射線照射，共72 h；⑤化療組：用20 nmol/L順鉑處理細(xì)胞72 h；⑥二甲雙胍+化療組：同時用20 mmol/L 二甲雙胍和20 nmol/L順鉑處理細(xì)胞72 h。每組3瓶。

1.2.8MTT法檢測宮頸癌干細(xì)胞的存活率 取各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以6×104個/L濃度接種于一次性96孔板的各孔內(nèi)，以DMSO為空白組，每組6個復(fù)孔，每孔內(nèi)細(xì)胞懸液體積為100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，去除未貼壁細(xì)胞，后續(xù)培養(yǎng)同1.2.4。

1.2.9流式細(xì)胞術(shù)檢測二甲雙胍對胃癌干細(xì)胞凋亡的影響 取各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞至流式專用離心管中，每管內(nèi)加入70%乙醇1 ml，4℃固定24 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS懸浮細(xì)胞懸浮，向每管內(nèi)加入0.5 ml碘化丙啶，37℃避光染色30 min，在流式細(xì)胞儀上波長488 nm處檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.10Western印跡檢測各組宮頸癌干細(xì)胞Nanog和Sox-2的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用全細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，10 000 r/min離心3 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法檢測試提取蛋白樣品濃度，煮沸法使樣品變性，10%凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入兔抗人Nanog、Sox-2單克隆抗體，4℃孵育12 h，隨后用山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像系統(tǒng)中顯色，以β-actin為內(nèi)參考，用Quantiy One軟件測量條帶灰度，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值來半定量目的蛋白。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析與繪圖，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌干細(xì)胞的鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1 d，SiHa細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)基中；培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞聚集生長，形成球狀細(xì)胞團，結(jié)構(gòu)較松散；培養(yǎng)14 d后，腫瘤細(xì)胞球體積增大，細(xì)胞排列緊密，界限不清，即出現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞富集。免疫熒光染色結(jié)果顯示，腫瘤球中的細(xì)胞表達(dá)CD133(綠色熒光)和Oct4(紅色熒光)。見圖1。

圖1 宮頸癌干細(xì)胞的鑒定(免疫熒光染色，×400)

2.2二甲雙胍最佳作用濃度與時間的篩選 MTT檢測結(jié)果顯示，隨著二甲雙胍作用濃度的升高和作用時間的延長，宮頸癌干細(xì)胞的存活率呈下降趨勢；作用24 h，20 mmol/L濃度組細(xì)胞存活率低于0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L濃度組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；作用48和72 h，10 mmol/L和20 mmol/L濃度組細(xì)胞存活率顯著低于0 mmol/L和5 mmol/L濃度組(P<0.05)；10 mmol/L和20 mmol/L濃度組作用48 h和72 h，細(xì)胞存活率顯著低于作用24 h (P<0.05)；10 mmol/L和20 mmol/L濃度組作用72 h，細(xì)胞存活率顯著低于作用48 h(P<0.05)。見表1。

表1 二甲雙胍對宮頸癌干細(xì)胞存活率的影響

2.3順鉑最佳作用濃度的篩選 MTT檢測結(jié)果顯示，作用48 h和72 h后，20 nmol/L和40 nmol/L濃度組細(xì)胞存活率顯著低于0 nmol/L和10 nmol/L濃度組(P<0.05)；10 nmol/L濃度組作用72 h，細(xì)胞存活率顯著低于作用24 h (P<0.05)；20 nmol/L和40 nmol/L濃度組作用48 h和72 h，細(xì)胞存活率顯著低于作用24 h (P<0.05)。見表2。

表2 順鉑對宮頸癌干細(xì)胞存活率的影響

2.4放療最佳作用劑量的篩選 MTT檢測結(jié)果顯示，作用48 h和72 h后，8、16 Gy劑量組細(xì)胞存活率顯著低于0、4 Gy劑量組(P<0.05)；8、16 Gy劑量組作用48 h和72 h，細(xì)胞存活率顯著低于作用24 h(P<0.05)。見表3。

表3 放療對宮頸癌干細(xì)胞存活率的影響

2.5二甲雙胍對各組宮頸癌干細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，二甲雙胍組、放療組、二甲雙胍+放療組、化療組、二甲雙胍+化療組細(xì)胞均顯著低于對照組(P<0.05)；二甲雙胍+放療組、二甲雙胍+化療組細(xì)胞存活率顯著低于二甲雙胍組和放療組(P<0.05)；二甲雙胍+化療組細(xì)胞存活率顯著低于化療組(P<0.05)。見表4。

表4 二甲雙胍對各組宮頸癌干細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6二甲雙胍對各組宮頸癌干細(xì)胞凋亡的影響 流式檢測結(jié)果顯示，二甲雙胍組、放療組、二甲雙胍+放療組、化療組、二甲雙胍+化療組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)；二甲雙胍+放療組、二甲雙胍+化療組細(xì)胞凋亡率顯著高于二甲雙胍組和放療組(P<0.05)；二甲雙胍+化療組細(xì)胞凋亡率顯著高于化療組(P<0.05)。見表4。

2.7二甲雙胍對宮頸癌干細(xì)胞中Nanog表達(dá)的影響 Western印跡檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中Nanog蛋白的陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖2。

1～6：對照組、二甲雙胍組、放療組、二甲雙胍+放療組、化療組、二甲雙胍+化療組圖2 Western印跡檢測Nanog表達(dá)

3 討 論

針對宮頸癌干細(xì)胞的治療有望解決宮頸癌的放化療抵抗問題。近年來，雖然對宮頸癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和表面標(biāo)志物等方面有了較深入的研究，但宮頸癌腫瘤干細(xì)胞的放化療抵抗和自我更新機制尚未完全明確，應(yīng)用化合物有效控制宮頸癌干細(xì)胞生長的研究不多〔16〕。Nayak等〔17〕應(yīng)用小分子化合物體外處理宮頸癌干細(xì)胞可提高該細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。Yokoi等〔18〕的研究發(fā)現(xiàn)一種選擇性的轉(zhuǎn)錄活性抑制劑可有效清除宮頸癌干細(xì)胞。Bigoni-Ordóez等〔19〕的研究則發(fā)現(xiàn)碘可以降低宮頸癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，從而減弱腫瘤干細(xì)胞的自我增殖能力。張燕華等〔20〕的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素抑制宮頸癌干細(xì)胞的增殖與聚集并提高其化療敏感性。王雪莉等〔21〕研究證實，紫花牡荊素可抑制宮頸癌干細(xì)胞的增殖。以上對所應(yīng)用藥物的研究均處于基礎(chǔ)體外實驗階段，與臨床相距甚遠(yuǎn)。于是，本研究把著眼點放在了臨床常用藥上，也為老藥新用開辟新思路。二甲雙胍是具有良好耐受性的抗腫瘤藥物〔22〕。臨床試驗已展開二甲雙胍對卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等的治療〔23〕。本研究通過二甲雙胍體外干預(yù)宮頸癌干細(xì)胞也觀察到二甲雙胍具有抑制宮頸癌干細(xì)胞增殖及和提高放化療敏感性的作用。

王華等〔24〕的研究證實，宮頸癌干細(xì)胞是人宮頸癌SiHa細(xì)胞株對順鉑產(chǎn)生耐藥的主要機制之一。Gu等〔25〕、Zhang等〔26〕、Yang等〔27〕和Wu等〔28〕的研究均證實，CD24+/CD44+可作為宮頸癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物。Oct4是一種常見的干細(xì)胞相關(guān)基因，作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在干細(xì)胞抗凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用〔29〕。本研究免疫熒光染色結(jié)果提示所分選的宮頸癌干細(xì)胞可用于本實驗。本研究MTT結(jié)果提示二甲雙胍對宮頸癌干細(xì)胞增殖的抑制作用呈時間與劑量依賴性。為了確定放療劑量與順鉑作用濃度，本研究分別應(yīng)用梯度放療劑量和順鉑濃度作用于宮頸癌干細(xì)胞，MTT結(jié)果顯示宮頸癌干細(xì)胞的存活率對放療和化療沒有明顯的時間和劑量依賴性。以上結(jié)果與等Kwon等〔30〕和Tyagi等〔31〕的研究結(jié)果一致，兩項研究均證實宮頸癌干細(xì)胞具有放療和化療抵抗的特性。

臨床上普遍認(rèn)為宮頸癌放療與化療失敗的主要原因是局部腫瘤增殖不受控制或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且宮頸癌根治術(shù)后經(jīng)放化療復(fù)發(fā)的患者再次接受放療時療效較差，以上情況均與放化療抵抗有關(guān)，而腫瘤干細(xì)胞可能是其根源〔32，33〕。本研究細(xì)胞存活和凋亡結(jié)果說明二甲雙胍可能具有放療和化療協(xié)同效應(yīng)，可提高宮頸癌干細(xì)胞對輻射和順鉑的敏感性。腫瘤細(xì)胞來源于腫瘤干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞的干性是腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的主要原因。王華等〔34〕的研究顯示，Oct3/4可通過上調(diào)腫瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵性基因Nanog來維持腫瘤干細(xì)胞的干性。Nanog是特異性表達(dá)于胚胎干細(xì)胞中的基因，在維持干細(xì)胞的自我更新和亞全能性方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用，也是細(xì)胞全能性或多能性的標(biāo)志物〔35，36〕。本研究Western印跡檢測結(jié)果說明二甲雙胍可能不能改變宮頸癌干細(xì)胞的干性。

綜上所述，二甲雙胍具有抑制宮頸癌干細(xì)胞增殖的作用，并可提高宮頸癌干細(xì)胞對放療或化療的敏感性，但不影響宮頸癌干細(xì)胞的干性。宮頸癌干細(xì)胞可能成為二甲雙胍的又一治療靶細(xì)胞，為二甲雙胍在放化療增敏的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。