過表達(dá)miR-30b-3p靶向CXCL16對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

景增秀 康桂蘭 魏秀邦 劉彥武

(1西寧市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，青海 西寧 810003；2吳忠市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科)

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的血栓形成是高血壓、冠心病等多種心血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)〔1,2〕。研究顯示，氧化應(yīng)激可通過促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎癥因子，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促使細(xì)胞凋亡等方式損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞〔3,4〕。氧化應(yīng)激造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要是由于活性氧介導(dǎo)的，過氧化氫(H2O2)是活性氧類物質(zhì)之一，常用于體外氧化應(yīng)激模型的建立〔5〕。微小RNA(miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，長度為18～25個(gè)核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄后抑制或降解mRNA的翻譯調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展〔6〕。研究表明，miR-30b-3p在肝臟缺血再灌注損傷小鼠的肝組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR-30b-3p可減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷〔7〕。miR-30b的過表達(dá)對糖氧剝奪誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)損傷〔8〕。目前，miR-30b-3p是否影響H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡還未知。本研究主要探討了miR-30b-3p對H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞EVC-304氧化應(yīng)激和凋亡的影響及其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 EVC-304細(xì)胞，武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心；胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；血清CXC趨化因子配體(CXCL)16抗體，美國Novus公司；GAPDH、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3抗體，美國Santa Cruz公司；miR-30b-3p模擬物(mimics)陰性對照、CXCL16的siRNA及陰性對照，上海Gnen Pharma公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，南京森貝伽生物公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物還原酶(GSH-Px)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇EVC-304細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%～90%后，0.25%胰蛋白酶溶液消化，更換新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期EVC-304細(xì)胞分組處理。對照組(Con組)：正常培養(yǎng)EVC-304細(xì)胞，不做任何處理；H2O2組：100 μmol/L的H2O2作用EVC-304細(xì)胞12 h〔9〕；H2O2+miR-30b-3p 組：EVC-304細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b-3p mimics 24 h后再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h；H2O2+miR-NC組：EVC-304細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30b-3p mimics陰性對照24 h后，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h；H2O2+si-CXCL16組：EVC-304細(xì)胞轉(zhuǎn)染CXCL16的siRNA干擾24 h后，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h；H2O2+si-NC組：EVC-304細(xì)胞轉(zhuǎn)染CXCL16的siRNA陰性對照24 h后，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h；H2O2+miR-30b-3p+pcDNA-CXCL16組：共轉(zhuǎn)染miR-30b-3p mimics和CXCL16過表達(dá)質(zhì)粒24 h后，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h；H2O2+miR-30b-3p+pcDNA組：共轉(zhuǎn)染miR-30b-3p mimics和空質(zhì)粒24 h后，再加入終濃度為100 μmol/L的H2O2作用12 h。轉(zhuǎn)染具體步驟按照 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-30b-3p和CXCL16 mRNA Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA純度和濃度。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-30b-3p以U6為內(nèi)參，CXCL16以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-30b-3p和CXCL16 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達(dá) 處理后的各組細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。取適量蛋白，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min使其變性后，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVEF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入辣根據(jù)過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件對蛋白含量進(jìn)行半定量分析。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測MDA、SOD和GSH-Px 處理后的各組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS清洗后，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。3 500 r/min離心10 min，收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別檢測MDA、SOD和GSH-Px水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 處理后的各組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS清洗后棄上清液，加入400 μl結(jié)合緩沖液制成單細(xì)胞懸液，然后依次加入5 μl Annexin V和5 μl的PI，室溫避光染色15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 生物信息預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-30b-3p與CXCL16的3′UTR存在結(jié)合序列，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增結(jié)合序列。將miR-30b-3p與CXCL16基因的結(jié)合片段插入到熒光素酶載體中，構(gòu)建CXCL16野生型質(zhì)粒(WT-CXCL16)。并利用基因突變技術(shù)將個(gè)別核苷酸結(jié)合位點(diǎn)序列突變，構(gòu)建CXCL16突變型質(zhì)粒(MUT-CXCL16)。使用LipofectamineTM2000將WT-CXCL16、MUT-CXCL16質(zhì)粒分別與miR-30b-3p mimics及陰性對照共轉(zhuǎn)染至EVC-304細(xì)胞，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書，檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1H2O2處理對EVC-304細(xì)胞miR-30b-3p和CXCL16表達(dá)的影響 與Con組比較，H2O2組EVC-304細(xì)胞中miR-30b-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CXCL16 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測CXCL16蛋白表達(dá)

表1 H2O2處理對EVC-304細(xì)胞miR-30b-3p和CXCL16表達(dá)的影響

2.2miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 H2O2+miR-30b-3p組miR-30b-3p水平顯著高于H2O2+miR-NC組(P<0.05)，表明miR-30b-3p mimics轉(zhuǎn)染成功。與Con組比較，H2O2組MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平顯著降低(P<0.05)。與H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-30b-3p組MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，H2O2組凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)，Bax和酶切caspase3水平顯著升高(P<0.05)。與H2O2+miR-NC組比較，H2O2+miR-30b-3p組凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，Bax和酶切caspase3水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3、圖3。

1～4：con組,H2O2組,H2O2 miR-NC組,H2O2+miR-30b-3p組圖2 Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞凋亡的影響

表3 miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞凋亡的影響

2.4抑制CXCL16表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 H2O2+si-CXCL16組CXCL16蛋白水平顯著低于H2O2+siNC組(P<0.05)，表明EVC-304細(xì)胞中CXCL16蛋白表達(dá)被抑制。與H2O2+si-NC組比，H2O2+si-CXCL16組MDA水平顯著降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，CXCL16、Bax和酶切caspase3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；見圖4、表4。

1，2：H2O2+si-NC組,H2O2+si-CXCL16組圖4 Western印跡檢測CXCL16及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制CXCL16表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

2.5miR-30b-3p靶向調(diào)控CXCL16的表達(dá) 生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，CXCL16的3′UTR中含有與miR-30b-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示miR-30b-3p可能調(diào)控CXCL16表達(dá)。見圖5。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-30b-3p mimics可顯著降低WT-CXCL16的熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-CXCL16的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)，見表5。表明miR-30b-3p可與CXCL16的3′UTR結(jié)合。miR-30b-3p組CXCL16蛋白水平(0.21±0.02)顯著低于miR-NC組(0.45±0.05，P<0.05)，anti-miR-30b-3p組CXCL16蛋白水平(0.87±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.43±0.04，P<0.05)，表明miR-30b-3p負(fù)調(diào)控CXCL16表達(dá)，見圖6。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖5 CXCL16的3′UTR中含有與miR-30b-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.6CXCL16過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用 與H2O2+miR-30b-3p+pcDNA組比較，H2O2+miR-30b-3p+pcDNA-CXCL16組MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，CXCL16、Bax和酶切caspase3蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖7和表6。

1～4：miR-NC組，miR-30b-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-30b-3p組圖6 Western印跡檢測CXCL16表達(dá)

1，2：H2O2+miR-30b-3p+pcDNA組，miR-30b-3p+pcDNA-CXCL16組圖7 Western印跡檢測

表6 CXCL16過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-30b-3p過表達(dá)對H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種生理功能，參與維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓及凝血與抗凝平衡等生命活動(dòng)〔10〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)，而氧化應(yīng)激可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損〔11〕。SOD和GSH-Px是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可緩解細(xì)胞的氧化損傷，并修復(fù)受損的細(xì)胞，其活性高低是反映機(jī)體抗氧化損傷程度的直觀指標(biāo)〔12〕。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平升高可加劇細(xì)胞損傷，可反映細(xì)胞受損的程度〔13〕。本研究結(jié)果表明H2O2誘導(dǎo)EVC-304細(xì)胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，并促進(jìn)了EVC-304細(xì)胞凋亡。

miRNA參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為，與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。有報(bào)道稱，miR-126、miR-181a、miR-217等多個(gè)miRNA參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且一些miRNA在氧化應(yīng)激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，一些miRNA表達(dá)下調(diào)〔14〕。上調(diào)miR-23b表達(dá)可能通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活減少H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，對H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用〔15〕。過表達(dá)miR-138能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2的凋亡〔16〕。本研究結(jié)果提示miR-30b-3p參與EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。過表達(dá)miR-30b-3p可提高H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞中SOD和GSH-Px水平，降低MDA水平，表明過表達(dá)miR-30b-3p可降低H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)；表明過表達(dá)miR-30b-3p可降低H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞凋亡。

CXCL16是新近發(fā)現(xiàn)的CXC(α亞族)趨化因子家族新成員，參與心力衰竭、腦梗死等心血管疾病的發(fā)展過程〔17,18〕。研究顯示，脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中CXCL16表達(dá)上調(diào)〔19〕。抑制CXCL16表達(dá)可降低低密度脂蛋白誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞活性氧表達(dá)，發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用〔20〕。本研究結(jié)果提示CXCL16也參與H2O2誘導(dǎo)的EVC-304細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡，miR-30b-3p可能通過調(diào)控CXCL16表達(dá)發(fā)揮作用；miR-30b-3p在EVC-304細(xì)胞中負(fù)調(diào)控CXCL16表達(dá)。