miR-214-5p通過調(diào)控SFRP2影響人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡

林顏 阮樹斌 陳曉東 楊榮華 王婧薷 林澤鵬 信琪

(佛山市第一人民醫(yī)院燒傷整形創(chuàng)面修復(fù)外科，廣東 佛山 528000)

瘢痕疙瘩形成過程主要涉及瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖活力增強及細胞凋亡能力不斷削弱等過程，而皮膚傷害或持續(xù)性刺激均可造成瘢痕疙瘩〔1〕。目前關(guān)于瘢痕疙瘩發(fā)病機制尚未完全闡明，導(dǎo)致瘢痕疙瘩的治療成為醫(yī)學(xué)難題〔2〕。因此，如何抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并促使其凋亡成為主要研究領(lǐng)域。研究表明微小RNA-214(miR-214)在瘢痕疙瘩中表達水平顯著低于正常皮膚組織，但其具體作用機制尚未見報道〔3〕。已有研究表明微小RNA-214-5p(miR-214-5p)在骨肉瘤和肝癌中均呈下調(diào)表達，miR-214-5p過表達可抑制骨肉瘤細胞和肝癌細胞增殖、遷移和侵襲〔4,5〕。但miR-214-5p對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、凋亡的影響尚未可知。利用生物信息網(wǎng)站預(yù)測miR-214-5p可能調(diào)控靶基因，發(fā)現(xiàn)分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)2在瘢痕疙瘩中呈高表達〔6,7〕。本研究通過miR-214-5p過表達與沉默SFRP2表達并觀察人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購自上海博升生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒與Annexin V凋亡檢測試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SFRP2抗體購自美國Santa Cruz公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒均購自大連寶生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC均購自上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司；熒光素酶表達載體及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自美國Progema公司。

1.2方法

1.2.1人瘢痕疙瘩成纖維細胞培養(yǎng) 選取2017年2～10月佛山市第一人民醫(yī)院收治的10例瘢痕疙瘩患者為研究組，所有患者進行手術(shù)切除，于術(shù)中切取瘢痕疙瘩組織，置于-80℃超低溫冰箱保存。另選取同期佛山市第一人民醫(yī)院收治的10例非瘢痕疙瘩患者為對照組，于術(shù)中切取正常皮膚組織，置于-80℃超低溫冰箱保存。術(shù)前患者均未接受藥物或其他治療，且患者及家屬均知情且簽署同意書。取出凍存組織標本，去除結(jié)締組織后置于離心管內(nèi)，加入膠原酶溶液(含1 g/L的RPMI1640)，離心后置于恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，10 h后棄未消化組織標本，經(jīng)1 200 r/min轉(zhuǎn)速的離心機離心5 min，棄上清液后加入RPMI640混勻，1 200 r/min轉(zhuǎn)速的離心機離心5 min后棄上清液，然后加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，混勻后調(diào)整細胞濃度，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，待細胞貼壁生長至80%左右時進行傳代培養(yǎng)，分別收集生長良好的瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)與正常皮膚成纖維細胞(NFB)進行后續(xù)研究。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染及分組 收集KFB細胞并經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板，依據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將miR-214-5p mimic、miR-NC、si-SFRP2、si-NC轉(zhuǎn)染至KFB細胞，分別為miR-214-5p組、miR-NC組、si-SFRP2組、si-NC組。將pcDNA-SFRP2質(zhì)粒(miR-214-5p+pcDNA-SFRP2組)、pcDNA質(zhì)粒(miR-214-5p+pcDNA組)分別與miR-214-5p mimic共同轉(zhuǎn)染至KFB細胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞中miR-214-5p、SFRP2 mRNA表達水平 取各組細胞分別加入1 ml Trizol裂解細胞并提取總RNA，應(yīng)用分光光度計測定RNA濃度與純度并經(jīng)凝膠電泳檢測條帶是否完整，取1 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-214-5p、SFRP2引物均由上海生物工程股份有限公司合成，按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書配置qRT-PCR反應(yīng)體系20 μl，ABI 7500 qRT-PCR儀檢測miR-214-5p、SFRP2 mRNA相對表達量。

1.2.4Western印跡蛋白表達量 分別收集各組細胞，分別加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法定量蛋白，制備蛋白樣品與上樣緩沖液混合液，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下脫脂奶粉封閉1 h，4℃條件下加入蛋白一抗(1∶1 000)孵育24 h，TBST洗膜，室溫下分別加入IgG二抗(1∶3 000)孵育2 h，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.5MTT檢測細胞增殖活力 分別收集各組KFB細胞，經(jīng)胰酶消化后接種至96孔板(1×104個細胞/孔)，24 h、48 h、72 h時每孔分別加入20 μl MTT溶液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后棄上清，每孔分別加入150 μl DMSO振蕩10 min，應(yīng)用酶標儀檢測波長為490 nm時各孔相對吸光度值(OD)。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組KFB細胞，0.25%胰酶消化細胞，調(diào)整細胞濃度(1×106個細胞/ml)，配制Annexin V-FITC(5 μl)與結(jié)合(500 μl)，分別加入KFB細胞，室溫避光孵育15 min，分別加入5 μl PI，利用流式細胞儀在1 h內(nèi)完成檢測，計算各組KFB細胞凋亡率，細胞凋亡率=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測 miR-214-5p和SFRP2的靶向關(guān)系 通過靶基因預(yù)測軟件檢索調(diào)控SFRP2的基因，發(fā)現(xiàn)miR-214-5p可能調(diào)控SFRP2基因，構(gòu)建含有miR-214-5p結(jié)合位點的野生型WT-SFRP2質(zhì)粒與含有miR-214-5p結(jié)合位點突變的突變型MUT-SFRP2質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將WT-SFRP2、MUT-SFRP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KFB細胞，然后轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic或miR-NC培養(yǎng)24 h，根據(jù)雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞熒光值。分別將miR-NC、miR-214-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-214-5p轉(zhuǎn)染至KFB細胞(miR-NC組、miR-214-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-214-5p組)，培養(yǎng)48 h后收集細胞，采用Western印跡檢測SFRP2蛋白表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1KFB和NFB中miR-214-5p和SFRP2表達水平比較 KFB細胞中miR-214-5p表達水平顯著低于NFB細胞(P<0.05)，而SFRP2 mRNA與蛋白表達水平顯著高于NFB組(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 SFRP2蛋白在KFB和NFB中的表達

表1 miR-214-5p在KFB和NFB中的表達

2.2miR-214-5p過表達對KFB增殖的影響 miR-214-5p組KFB細胞增殖活力明顯低于miR-NC組(P<0.05)，與miR-NC組相比，miR-214-5p組CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而p21、p27蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 miR-214-5p過表達對KFB中增殖相關(guān)蛋白表達的影響

表2 miR-214-5p過表達對KFB增殖的影響

2.3miR-214-5p過表達對KFB凋亡的影響 轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic后KFB細胞凋亡率顯著高于miR-NC組(P<0.05)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bax、酶切caspase-3表達水平均顯著升高(P<0.05)，見圖3、圖4、表3。

圖3 miR-214-5p過表達對KFB中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

圖4 miR-214-5p過表達對KFB中凋亡率的影響

表3 miR-214-5p過表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞(KFB)凋亡的影響

2.4miR-214-5p靶向調(diào)控SFRP2的表達 SFRP2與miR-214-5p存在結(jié)合位點，見圖5。共轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic與WT-SFRP2野生型質(zhì)粒的KFB細胞相對熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-SFRP2野生型質(zhì)粒的KFB細胞(P<0.05)，表明miR-214-5p可與SFRP2基因的3′UTR結(jié)合而調(diào)控其活性。miR-214-5p組SFRP2蛋白(0.17±0.03)顯著低于miR-NC組(0.58±0.05，P<0.05)；anti-miR-214-5p組SFRP2蛋白(0.92±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.59±0.06,P<0.05)。見圖6、表4。

1～4:miR-NC組，miR-214-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-214-5p組圖6 miR-214-5p調(diào)控SFRP2蛋白的表達

圖5 SFRP2的3′UTR中含有與miR-214-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5抑制SFRP2表達對KFB增殖和凋亡的影響 相較于si-NC組，轉(zhuǎn)染si-SFRP2可顯著抑制細胞增殖及顯著促進細胞凋亡，見圖7、表5。

圖7 抑制SFRP2表達對KFB增殖、凋亡蛋白表達的影響

表5 抑制SFRP2表達對KFB增殖和凋亡的影響

2.6SFRP2過表達逆轉(zhuǎn)了miR-214-5p過表達對KFB增殖和凋亡的作用 共轉(zhuǎn)染miR-214-5p mimic與pcDNA-SFRP2后細胞增殖活力顯著高于miR-214-5p+pcDNA組(P<0.05)，與miR-214-5p+pcDNA組比較，miR-214-5p+pcDNA-SFRP2組細胞凋亡能力顯著降低(P<0.05)，見圖8、表6。

1～2：miR-214-5p+pcDNA組，miR-214-5p+pcDNA-SFRP2組圖8 SFRP2過表達逆轉(zhuǎn)了miR-214-5p過表達對KFB增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的作用

表6 SFRP2過表達逆轉(zhuǎn)了miR-214-5p過表達對KFB增殖和凋亡的作用

3 討 論

瘢痕疙瘩形成實質(zhì)為結(jié)締組織增生，主要是創(chuàng)傷愈合后結(jié)痂部分過度生長導(dǎo)致的一種異常瘢痕組織，嚴重影響患者身心健康，目前臨床尚無有效治療方案〔8〕。研究表明KFB增殖過快及細胞非正常凋亡是導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成的主要原因〔9〕。miRNA可通過抑制靶基因表達進而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達，從而減緩瘢痕形成〔10〕。

miR-214-5p在胰腺癌細胞中呈低表達，上調(diào)miR-214-5p表達可抑制胰腺癌細胞遷移及侵襲〔11〕。Li等〔12〕研究表明miR-214-5p可通過調(diào)控基因表達進而抑制肝細胞癌細胞遷移及侵襲。研究報道指出miR-214-5p可通過靶向調(diào)節(jié)Ⅳ型膠原蛋白α表達，進而抑制成骨細胞MC3T3-E1細胞存活及細胞外基質(zhì)形成過程〔13〕。miR-214-5p的表達變化主要集中于腫瘤發(fā)生及發(fā)展進程。本研究結(jié)果說明miR-214-5p表達水平降低可能參與瘢痕形成過程。miR-214-5p過表達后KFB細胞中p21、p27蛋白表達水平升高，而CyclinD1蛋白表達水平降低。研究顯示p21、p27蛋白表達水平升高可抑制CyclinD1與CDK4/6形成復(fù)合物，并誘導(dǎo)細胞周期停滯，抑制細胞增殖〔14,15〕。同時本研究結(jié)果提示miR-214-5p過表達能夠通過影響凋亡相關(guān)蛋白表達進而促進KFB凋亡。

研究表明SFRP2在KFB中呈高表達，并可通過調(diào)控Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路進而參與傷口愈合過程〔16～18〕。本研究結(jié)果提示miR-214-5p可能通過調(diào)控靶基因SFRP2表達，進而參與瘢痕疙瘩形成過程。本研究結(jié)果提示miR-214-5p可通過抑制SFRP2表達，進而抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上，miR-214-5p過表達能明顯抑制KFB增殖活性，并提高細胞凋亡水平，其作用機制可能為通過抑制靶基因SFRP2表達而發(fā)揮作用的，并可通過調(diào)控細胞增殖及凋亡蛋白表達進而調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖/凋亡的平衡狀態(tài)。