miR-539-5p通過靶基因TPX2調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的分子機(jī)制

葉艷芳 韓芬 劉健峰 徐文濤

(鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，河南 鄭州 450000)

胃癌屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率較高，隨著年齡的增長胃癌患者發(fā)病率總體呈上升趨勢，目前臨床主要采用手術(shù)切除并輔以放化療的手段進(jìn)行治療，但進(jìn)展期或晚期胃癌患者不可進(jìn)行手術(shù)，而采用放療或化療等治療手段對患者身體造成一定毒副作用甚至降低患者生存質(zhì)量〔1〕。因而積極探尋胃癌發(fā)病機(jī)制及其治療方法對降低胃癌死亡率及改善患者預(yù)后均具有重要意義。研究表明微小RNA-539(miR-539)在骨肉瘤組織中表達(dá)降低，其低表達(dá)與患者TNM分級及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔2〕。miR-539通過調(diào)控SPAG5的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔3〕。研究報(bào)道指出微小RNA-539-5p(miR-539-5p)在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長〔4〕。但關(guān)于miR-539-5p在胃癌中的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響尚未可知。Xklp2 靶蛋白(TPX2)在胃癌、乳腺癌中高表達(dá)，沉默TPX2表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔5，6〕。下調(diào)TPX2表達(dá)能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞的克隆形成能力〔7〕。在宮頸癌細(xì)胞過表達(dá)TPX2基因后，能抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)其侵襲能力〔8〕。通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)TPX2可能是miR-539-5p的靶基因，然而miR-539-5p是否通過靶向TPX2調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究探討miR-539-5p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，通過上調(diào)胃癌細(xì)胞中miR-539-5p的表達(dá)，觀察胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力變化，分析其與TPX2是否存在靶向調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞(GES)-1與胃癌細(xì)胞系MGC-803、MKN-45、AGS均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；青霉素(100 U/ml)與鏈霉素(0.1 mg/ml)購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒與LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；甲基噻唑基四唑(MTT) 與二甲基亞砜(DMSO)均購自瑞士Roche公司；miR-539-5p mimics及對照、TPX2小干擾RNA(si-TPX2)及對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購自美國Milipore公司；兔抗人TPX2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；Transwell小室購自美國康寧公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1與胃癌細(xì)胞MGC-803、MKN-45、AGS均培養(yǎng)于含有10%FBS及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，用于提取細(xì)胞RNA并檢測細(xì)胞系中miR-539-5p和TPX2的表達(dá)情況。待細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速4℃離心10 min，收集胃癌MGC-803細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基稀釋為細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/ml，吸取2 ml MGC-803細(xì)胞接種于6孔板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組為：miR-539-5p組、miR-NC組、si-TPX2組、si-NC組、miR-539-5p+pcDNA-TPX2組、miR-539-5p+pcDNA組。采用無菌無酶EP管配置LipofectamineTM2000與miR-539-5p mimics、si-TPX2、miR-539-5p抑制劑(anti-miR-539-5p)、TPX2過表達(dá)載體(pcDNA-TPX2)轉(zhuǎn)染試劑，依次配置完成后，充分混勻，置于室溫放置20 min，將其加入不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基，加入待轉(zhuǎn)染的6孔板內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)基更換為含有10%FBS及雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，可進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移、侵襲及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究，還可繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞提取RNA及蛋白檢測相關(guān)基因或蛋白表達(dá)。

1.2.2qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞中miR-539-5p、TPX2 mRNA表達(dá)水平 收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，每孔分別加入100 μl Trizol試劑，隨后依次加入氯仿，室溫振蕩15 s后放置5 min，4℃條件下，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，吸取上層液體置于另一無菌無酶的EP管內(nèi)，加入異丙醇充分混勻后，室溫靜置10 min，4℃條件下，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇洗滌RNA，4℃條件下，7 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清，置于超凈工作臺內(nèi)晾干，加入20～30 μl DEPC水溶解RNA，吸取2 μl RNA檢測RNA濃度及純度，檢測時RNA A260/A280處于1.8～2.0提示RNA濃度適宜并可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。以RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，參照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系共20 μl，每組均設(shè)置3次重復(fù)，反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)40次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-539-5p、TPX2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3Western印跡檢測TPX2、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14的蛋白表達(dá) 收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)以此分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，分別加入蛋白一抗，TPX2蛋白稀釋比為1∶1 000，CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白稀釋比均為1∶500，TBST洗滌，分別加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，加入ECL，X膠片曝光，顯影及定影后，利用凝膠分析系統(tǒng)掃描并保存條帶圖片，應(yīng)用Quantity One軟件分析分析目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH的蛋白灰度值的比值，以此表示目的蛋白相對表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.4MTT檢測胃癌細(xì)胞增殖 分別收集轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h時胃癌MGC-803細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液(密度1×105個/ml)，按照每孔200 μl的密度將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每組均設(shè)置6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h每孔分別加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，放入恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔分別加入150 μl DMSO溶液，振蕩混勻后置于酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔光密度值，每個樣本均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞遷移及侵襲 收集轉(zhuǎn)染48 h后的胃癌MGC-803細(xì)胞，加入不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，同時用不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基以8∶1的比例稀釋基質(zhì)膠，將稀釋后的基質(zhì)膠包被于Transwell小室底部的上室面(侵襲實(shí)驗(yàn)鋪膠，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)未鋪膠)。分別取各組200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，將500 μl含有10%FBS及雙抗的DMEM培養(yǎng)基加入24板Transwell小室的下室，放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS洗滌，用棉簽擦去基質(zhì)膠及微孔膜上層細(xì)胞，采用多聚甲醛固定20 min，加入結(jié)晶紫染色15 min，置于倒置顯微鏡下計(jì)算轉(zhuǎn)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，每個樣本均隨機(jī)選取6個視野求取細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) TPX2的3′(非翻譯區(qū)UTR)區(qū)域序列預(yù)測與miR-539-5p有關(guān)，將預(yù)測序列插入pGL3的催化劑載體pGL3-TPX2-WT構(gòu)建野生型(WT)-TPX2載體，將預(yù)測靶點(diǎn)的變異序列整合后插入pGL3-TPX2-MUT構(gòu)建突變型(MUT)-TPX2載體，同時將胃癌MGC-803細(xì)胞接種于24孔板，將WT-TPX2載體、MUT-TPX2載體分別與miR-539-5p mimics及其對照共轉(zhuǎn)染入胃癌MGC-803細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測MGC-803細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-539-5p和TPX2在胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，胃癌MGC-803、MKN-45、AGS細(xì)胞中miR-539-5p的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而TPX2 mRNA及蛋白的表達(dá)的水平均顯著升高(P<0.05)，相較于其他胃癌細(xì)胞，miR-539-5p在胃癌MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)水平相對較低，因此后續(xù)研究中選取MGC-803細(xì)胞為研究材料。見圖1、表1。

圖1 TPX2蛋白表達(dá)

表1 miR-539-5p和TPX2在胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-539-5p過表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC組相比，miR-539-5p組胃癌MGC-803細(xì)胞中miR-539-5p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。miR-539-5p組胃癌MGC-803細(xì)胞48 h、72 h增殖活性較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，miR-539-5p組胃癌MGC-803細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)水平較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，而p21、p27的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 miR-539-5p過表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

2.3miR-539-5p過表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-539-5p組胃癌MGC-803細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05)，而細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 miR-539-5p過表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.4抑制TPX2表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-TPX2組胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯受到抑制(P<0.05)，與si-NC組比較，si-TPX2組胃癌MGC-803細(xì)胞中p21的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見表4、圖4。

表4 抑制TPX2表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

圖4 Western印跡檢測TPX2和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5miR-539-5p靶向調(diào)控TPX2的表達(dá) miR-539-5p可明顯抑制WT-TPX2的3′UTR的雙熒光素酶活性(P<0.05)，見圖5、表5。進(jìn)一步研究顯示miR-539-5p過表達(dá)可明顯降低胃癌MGC-803細(xì)胞TPX2的表達(dá)(miR-NC組：0.61±0.06、miR-539-5p組0.24±0.02，P<0.05)，而抑制miR-539-5p表達(dá)可明顯升高胃癌MGC-803細(xì)胞TPX2的表達(dá)(anti-miR-NC組：0.59±0.05、anti-miR-539-5p組：0.93±0.08，P<0.05)，見圖6。

圖5 TPX2的3′UTR中含有與miR-539-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖6 Western印跡檢測TPX2蛋白表達(dá)

2.6TPX2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-539-5p過表達(dá)對MGC-803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用 與miR-539-5p+pcDNA組相比，miR-539-5p+pcDNA-TPX2組胃癌MGC-803細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，而p21的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖7、表6。

1～4:miR-NC組、miR-539-5p組、miR-539-5p+pcDNA組、miR-539-5p+pcDNA-TPX2組圖7 Western印跡檢測TPX2和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 TPX2的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-539-5p過表達(dá)對MGC-803細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討 論

胃癌患者死亡率升高的主要原因?yàn)槟[瘤轉(zhuǎn)移，胃癌細(xì)胞遷移及侵襲引發(fā)胃癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制尚未完全闡明，目前臨床尚缺乏治療轉(zhuǎn)移性胃癌的有效治療手段〔9〕。miRNA可通過與靶基因結(jié)合而降解mRNA并抑制其翻譯從而調(diào)控基因表達(dá)，研究表明miRNA與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，張金梅等〔10，11〕研究表明miR-638可通過靶向調(diào)控性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2表達(dá)而抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲。但仍有部分miRNA與胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的內(nèi)在作用機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究擬積極探尋與胃癌細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)的miRNA。

miR-539可通過靶向抑制腳手架蛋白CARMA1表達(dá)進(jìn)而抑制甲狀腺癌細(xì)胞遷移〔12〕。佘青等〔13〕研究表明miR-539在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-539過表達(dá)可顯著降低乳腺癌細(xì)胞增殖能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Yu等〔14〕研究表明miR-539在胰腺癌中的表達(dá)水平降低，上調(diào)miR-539表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移。研究發(fā)現(xiàn)miR-539在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮抑癌基因作用，其可通過下調(diào)JAG1及Notch1/3表達(dá)進(jìn)而抑制Wilms腫瘤的進(jìn)展〔15〕。miR-539還可通過靶向高遷移率組蛋白A2表達(dá)進(jìn)而抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔16〕。以上研究結(jié)果表明miR-539在惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中均呈低表達(dá)，上調(diào)miR-539表達(dá)可抑制腫瘤進(jìn)展。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相似，說明miR-539-5p在胃癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮抑癌基因作用。本研究進(jìn)一步研究表明腫瘤細(xì)胞異常增殖與細(xì)胞周期調(diào)控紊亂有關(guān)，其中G1期轉(zhuǎn)變?yōu)镾期是細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵所在，CyclinD1可通過激活CDK4/CDK6而促進(jìn)G1期轉(zhuǎn)化為S期進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變過程，而p21與p27是CyclinD1與CDK4/CDK6的抑制劑，其可通過結(jié)合細(xì)胞周期蛋白及CDK而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期進(jìn)而抑制腫瘤生長〔17，18〕。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 miR-539-5p mimics后胃癌細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，并可明顯抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14表達(dá)，MMPs可降解細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的蛋白組分進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔19，20〕。說明轉(zhuǎn)染miR-539-5p mimics能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。提示miR-539-5p在胃癌發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用。

TPX2在多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，其表達(dá)量異常增高可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生癌變，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中均發(fā)揮癌基因作用進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，同時可增強(qiáng)細(xì)胞遷移及侵襲能力〔21〕。TPX2作為一種受細(xì)胞調(diào)控的微管相關(guān)蛋白，在舌鱗狀細(xì)胞癌、肝癌及食管癌等多種惡性腫瘤中的表達(dá)量均明顯增加，其可通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)而影響腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程〔22〕。Chen等〔23〕研究表明干擾TPX2表達(dá)后可通過抑制PI3K/AKT信號通路激活進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。段長勝等研究表明TPX2在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，其高表達(dá)量與患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但關(guān)于TPX2在胃癌轉(zhuǎn)移過程中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討〔24〕。與上述文獻(xiàn)報(bào)道相似，本研究結(jié)果說明沉默TPX2可通過影響細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程。提示沉默TPX2表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測TPX2可能為miR-539-5p的靶基因，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-539-5p與TPX2的靶向結(jié)合關(guān)系，結(jié)果提示miR-539-5p可負(fù)向調(diào)控靶基因TPX2表達(dá)。然而miR-539-5p與TPX2在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制尚未完全闡明，本研究結(jié)果表明miR-539-5p過表達(dá)可通過抑制TPX2表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。提示miR-539-5p可能作為胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上，胃癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中TPX2是miR-539-5p的一個功能性靶基因，miR-539-5p過表達(dá)可通過降低TPX2表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，為胃癌臨床分子治療奠定理論基礎(chǔ)。但關(guān)于miR-539-5p與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號通路的相關(guān)性仍需深入研究。