人參皂苷Rg3對大鼠頸動脈球囊損傷后TGF-β1/Smads通路的影響

陳文明 蹇明輝 趙然尊 石蓓

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563099)

在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)的治療過程中，經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI) 能快速開通血管，恢復(fù)血流，從而改善心肌的供血、供氧。目前，PCI已成為治療CHD的重要方法之一，對患者的治療效果明顯；但從患者遠(yuǎn)期療效來看，血管內(nèi)再狹窄(VRS)的發(fā)生，反而影響了患者的遠(yuǎn)期治療效果。因此，怎么解決PCI術(shù)后VRS的問題已成為防治CHD的研究熱點(diǎn)。人參皂苷(GS)Rg3是從人參中提取的一種四環(huán)三萜皂苷類化合物，具有多種藥理學(xué)活性。近年來有大量文獻(xiàn)報(bào)道，GSRg3能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高機(jī)體免疫力，而且對心腦血管也具有保護(hù)作用〔1～4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠頸動脈損傷后，GSRg3通過促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管內(nèi)膜的增生〔5,6〕，其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討GSRg3對球囊損傷頸動脈后血管內(nèi)膜增生的作用機(jī)制是否與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smads信號通路有關(guān)，為 PCI治療CHD提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選擇40只健康雄性SD大鼠(SPF級)，體重 280～320 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2主要藥品與試劑 GSRg3：批號為ZL20161016，純度>98%，購自上海篤瑪生物科技有限公司；TGF-β1和β-actin抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP 法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA 提取試劑盒均購自成都精邁生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒購自寶生物工程大連有限公司。

1.3主要儀器 PTCA球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(2.0 mm×12.0 mm)購自微創(chuàng)醫(yī)療器械(上海)有限公司；BX43正置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；Real-time PCR儀和酶標(biāo)儀均購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.4制備大鼠頸動脈球囊損傷模型 根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)〔5，6〕，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，然后再經(jīng)腹腔注射肝素鈉625 U/kg，于手術(shù)臺上固定大鼠，于頸部正中脫毛、剪開切口，分離左側(cè)頸總動脈，然后找到頸外、頸內(nèi)動脈分叉處，將分離出的頸外動脈離分叉處約1 cm 將其結(jié)扎；用動脈夾臨時阻斷頸左頸總動脈血流，由頸外動脈將球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(2.0 mm×12.0 mm)插入至頸總動脈，充盈球囊擴(kuò)張導(dǎo)管，將其緩慢來回抽拉3次，退出球囊，然后結(jié)扎頸外動脈。預(yù)防感染：術(shù)后立即給予頸動脈球囊損傷大鼠肌肉注射青霉素(30萬單位)，每日1次，連續(xù)3 d，進(jìn)行普通飼料，自由飲水。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)為成 4 組：假手術(shù)組，模型組，GSRg3低劑量組(5 mg/kg)，GSRg3高劑量組(10 mg/kg)，每組10只；假手術(shù)組只分離頸左總動脈血管，其余各組大鼠均用球囊擴(kuò)張導(dǎo)管(2.0 mm×12.0 mm)損傷左頸總動脈，術(shù)后待大鼠清醒后按照上述實(shí)驗(yàn)分組，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水〔5，6〕。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色 給予頸動脈損傷模型大鼠連續(xù)灌胃給藥14 d后，將模型大鼠麻醉處死，取出頸動脈損傷部位血管，經(jīng)石蠟包埋處理，進(jìn)行HE染色。使用Image-Pro Plus(IPP)圖像分析軟件測量模型大鼠頸動脈損傷血管的管腔面積、內(nèi)膜面積和中膜面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜的面積比值〔5，6〕。

1.7免疫組織化學(xué)法檢測TGF-β1蛋白表達(dá)水平 將上述包埋處理的蠟塊，進(jìn)行石蠟切片；將切片脫蠟、水合，滴加3%H2O2室溫避光孵育后，用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，根據(jù)免疫組織化學(xué)ABC法，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗抗體(TGF-β1 1∶200，β-actin 1∶200)4℃孵育過夜，再滴加二抗37℃孵育1 h；在普通光學(xué)顯微鏡下，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯色，用蘇木素返藍(lán)，然后脫水封片。頸動脈血管組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒，即為 TGF-β1蛋白陽性表達(dá)信號，利用IPP圖像分析軟件對切片中免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，并計(jì)算出陽性染色結(jié)果的平均光密度值。

1.8Real-time PCR檢測TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá) 用Trizol一步提取法，提取頸動脈損傷血管組織總RNA，檢測RNA的濃度及其純度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：TGF-β1：上游引物：5′-GGTGGACCGCAACAACG-3′，下游引物：5′-TGAGCACTGAAGCGAA AGC-3′，327 bp；Smad2：上游引物：5′-AAGCCATCACCACTCAGAATTG-3′，下游引物：5′-CACTGATCTACCGTATTTGCTGT-3′，100 bp；Smad3：上游引物：5′-TGGCTACCTGAGTGAAGATGG-3′，下游引物：5′-AGTTATTGTGTGCTGGGGACA-3′，110 bp；Smad7：上游引物：5′-CCAACTGCAGACTGTCCAGA-3′，下游引物：5′-CAGGCTCCAGAAGAAGTTGG-3′，106 bp；β-actin：上游引物：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCAATGGTGAT-3′，392 bp。將擴(kuò)增結(jié)果CT值采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，觀察目的基因表達(dá)的表達(dá)情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GSRg3 對球囊損傷后大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生的影響 假手術(shù)組血管內(nèi)膜光滑，無明顯增厚現(xiàn)象，模型組頸動脈血管內(nèi)膜增厚較假手術(shù)組明顯增加(P<0.01)，血管管腔縮小，同時，內(nèi)膜/中膜面積比也明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，給予GSRg3干預(yù)治療后，頸動脈血管內(nèi)膜增厚的程度明顯減輕(P<0.01)，血管管腔增大，內(nèi)膜/中膜面積比顯著下降(P<0.01)。見圖1，表1。說明GSRg3 具有抑制頸動脈血管經(jīng)球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生作用。

圖1 GSRg3 對球囊損傷后大鼠頸動脈血管內(nèi)膜增生的影響(HE，×100)

2.2GSRg3對球囊損傷后大鼠頸動脈血管TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 用免疫組織化法檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組頸動脈血管見有少量TGF-β1陽性表達(dá)，模型組頸動脈血管TGF-β1蛋白表達(dá)較假手術(shù)組比較明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，給予GSRg3干預(yù)后，頸動脈血管TGF-β1的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見表1、圖2。說明GSRg3能抑制頸動脈血管經(jīng)球囊損傷后TGF-β1蛋白表達(dá)。

圖2 GSRg3對球囊損傷后大鼠頸動脈血管TGF-β1蛋白表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué)法，×400)

2.3GSRg3對球囊損傷后大鼠頸動脈血管TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組損傷血管TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，Smad7 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，給予GSRg3干預(yù)后，損傷血管TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，Smad7 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。見表1。說明GSRg3能調(diào)節(jié)球囊損傷后大鼠頸動脈血管TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 的mRNA表達(dá)。

表1 各組頸動脈血管內(nèi)膜、中膜及內(nèi)膜/中膜面積、TGF-β1蛋白及TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

TGF-β1在細(xì)胞的生長、分化及在多種生理、病理過程中起重要調(diào)節(jié)作用，是TGF-β亞型中的一種。TGF-β1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)、血管成纖維細(xì)胞(VFb)等細(xì)胞中呈高表達(dá)，與血管損傷后VRS及血管纖維化重塑密切相關(guān)〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1主要是經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，迄今為止，TGF-β1的唯一作用底物是Smads〔8〕。Smads是線蟲Sma蛋白，與果蠅Mad蛋白具有同源性的蛋白家族，它們可以直接將TGF-β1信號經(jīng)細(xì)胞膜受體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。膜受體激活的Smad(R-Smads)，包括Smad2、3等，它們可與TGF-β1受體直接作用，經(jīng)磷酸化后，與Smad4結(jié)合，轉(zhuǎn)位入核，從而調(diào)節(jié)其下游相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄；在TGF-β1-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Smad7具有抑制作用，可與R-Smads競爭性地結(jié)合受體，阻止R-Smads的磷酸化，從而阻斷TGF-β1的效應(yīng)〔8〕。

近年來研究報(bào)道，在動脈粥樣硬化斑塊中和發(fā)生VRS的部位均有TGF-β1和Smads基因的表達(dá)，且具有較強(qiáng)的活性〔9，10〕。TGF-β1通過Smad蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，促進(jìn)VSMC的增殖、遷移及血管纖連蛋白的合成，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增殖〔11，12〕。大鼠頸動脈損傷后TGF-β/Smads信號通路被激活，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移，引起血管內(nèi)膜的增生〔13〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果印證了TGFβ1/Smads信號通路對血管內(nèi)膜增生具有促進(jìn)作用，提示大鼠頸動脈球囊損傷后，GSRg3能減輕血管內(nèi)膜的增生作用，可能與抑制TGFβ1的表達(dá)和Smads途徑的激活有關(guān)，從而減少細(xì)胞增殖信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，GSRg3能抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜增生，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smads通路的表達(dá)有關(guān)。