穩(wěn)斑湯激活Nrf2信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激緩解大鼠冠脈微循環(huán)障礙

張雯雯 金頌峰 趙國梁 宮麗鴻

(1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院；3遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

冠狀動(dòng)脈(冠脈)微循環(huán)是指微動(dòng)脈、微靜脈及毛細(xì)血管間的血液流通循環(huán)良好，而冠脈微循環(huán)障礙(CMD)是指上面三者構(gòu)成的微循環(huán)系統(tǒng)被不良因素影響導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)和功能改變。CMD的病理機(jī)制包括血液流變學(xué)改變、血管平滑肌功能障礙、心臟神經(jīng)系統(tǒng)失衡、氧自由基產(chǎn)生及冠脈內(nèi)皮功能失調(diào)等〔1，2〕。研究表明冠脈微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能障礙會(huì)影響心肌梗死、冠心病等疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。雖然經(jīng)皮冠脈介入治療和搭橋手術(shù)是有效的治療手段，但是患者術(shù)后的近期死亡率仍高達(dá)7%〔3〕。因此，保持冠脈微循環(huán)的完整性，從而改善其功能障礙顯得尤為重要。研究證實(shí)中藥復(fù)方對(duì)改善冠脈微循環(huán)障礙有較好功效，比如復(fù)方丹參滴丸〔4〕、麝香保心丸〔5〕等。穩(wěn)斑湯作為搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方，通過干預(yù)動(dòng)脈硬化不穩(wěn)定斑塊的形成及改善血管內(nèi)皮功能和血脂在動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病不穩(wěn)定型心絞痛等冠脈血管病變疾病中發(fā)揮著較好的療效〔6，7〕，但是穩(wěn)斑湯是否能改善大鼠CMD未見報(bào)道。本研究旨在探討穩(wěn)斑湯對(duì)CMD的改善效果及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雄性SD大鼠，4～6周齡，體重180～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(遼)2010-001。所有大鼠被安置在符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房間里，溫度18～24℃，相對(duì)濕度55%～65%，亮∶暗=1∶1，可自由取用食物和水。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑 穩(wěn)斑湯由全蝎10 g、蜈蚣2條、地龍15 g、陳皮15 g、半夏15 g、白術(shù)15 g、水蛭15 g組成，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室加工制成含生藥2 g/ml的濃縮液。月桂酸鈉購自Sigma公司；丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、前列腺素環(huán)(PG)I2和血栓素(TX)A2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；TM和EPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；預(yù)混液形式的逆轉(zhuǎn)錄試劑和2×實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的預(yù)混合溶液購自諾唯贊生物科技有限公司；兔抗Fyn、Nrf2、血紅素加氧酶(HO)-1、醌氧化還原酶(NQO)1和GAPDH抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗兔IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(5×)購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器)；倒置生物顯微鏡(德國Leica)；超低溫高速離心機(jī)(Thermo)；超低溫冰箱(青島海爾)；qPCR儀(Thermo)；Western印跡電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(南京德鐵)。

1.2方法

1.2.1大鼠CMD模型的制備及分組 采用隨機(jī)法將30只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、穩(wěn)斑湯組，每組10只。模型組、穩(wěn)斑湯組制備大鼠CMD，大鼠稱重并給予10%水合氯醛 (3 ml/kg)腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠取仰臥位固定，常規(guī)頸部及胸部備皮消毒，頸部正中切開皮膚鈍性分離暴露氣管，直視下經(jīng)氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，于左側(cè)第2肋間水平靠近胸骨左緣縱向切開肌肉，依次剪斷第2、3、4 肋，尋找并暴露主動(dòng)脈，用自制擴(kuò)胸器向左右兩側(cè)擴(kuò)張胸腔，使心尖部位暴露，使用一次性0.1 ml注射器由心尖部刺入左心室腔內(nèi)，迅速注入月桂酸鈉1 ml/kg (濃度1 mg/ml)，同時(shí)夾閉主動(dòng)脈升部與主動(dòng)脈弓連接處10 s，以使注入的月桂酸鈉試劑順利進(jìn)入冠脈。注射完成后迅速將心臟放入胸腔，待心跳平穩(wěn)后縫合肋骨和胸骨，關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮下組織和皮膚，待呼吸平穩(wěn)后拔除氣管插管。術(shù)中或術(shù)后出現(xiàn)心臟驟?；蛘吆粑Ｖ梗o予胸外心臟按壓。假手術(shù)組只做暴露操作而不作任何造模處理，術(shù)后常規(guī)給予青霉素鈉80萬U腹腔注射預(yù)防感染。穩(wěn)斑湯組給予8.55 g/kg灌胃處理，假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃7 d，每天1次，第8天給藥后2 h取材進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)〔8〕。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色觀測(cè)各組心臟微血管變化 將從各組大鼠分離出來左心室置于4%多聚甲醛中固定，脫水、透明、石蠟包埋隨后切片，厚度在4 μm左右，隔十取一，按照參考文獻(xiàn)所示的步驟對(duì)其進(jìn)行HE染色〔9〕。每組選取6張切片標(biāo)本，光鏡下觀察心肌組織和形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3ELISA法檢測(cè)各組血清中PGI2和TXA2水平 取各組大鼠全血，用1.5 ml離心管收集起來。室溫靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，將上清(即血清)收集到新的1.5 ml離心管中。采用PGI2和TXA2試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清中PGI2和TXA2含量。

1.2.4qPCR檢測(cè)各組左心室中TM和EPCR mRNA水平 用Trizol法提取各組大鼠左心室的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所示方法反轉(zhuǎn)成cDNA；構(gòu)建PCR。TM：上游引物：CCTTTGTCTTTCCGGGCTCT，下游引物：TCAAGTCCTCCCTACCCTCG；EPCR：上游引物：AACCGCACTCGGTATGAACT，下游引物：TGGCTTCACAGTGAGCTGAA；GAPDH：上游引物：TGATGGGTGTGAACCACGAG，下游引物：GCCCTTCCACAATGCCAAAG。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火55 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果用Ct值表示，基因的改變用2-△△Ct值表示。

1.2.5氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 各組稱取一定量的左心室組織，加入9倍體積的生理鹽水制成勻漿液，10 000 r/min離心5 min，取上清于新的1.5 ml離心管中作為待測(cè)樣品。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定樣品中SOD、MDA、CAT和 GSH的濃度。

1.2.6Western印跡檢測(cè)各組左心室中Fyn、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達(dá) 將各組大鼠左心室放入電動(dòng)勻漿器中勻漿，加入蛋白裂解液和終濃度為1 mmol/L的PMSF，在冰上裂解30 min。然后將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，4℃條件下離心，取少量上清液用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。以最低濃度為標(biāo)準(zhǔn)，加入一定量裂解液將各組蛋白調(diào)整至等濃度后，用等體積的蛋白上樣緩沖液稀釋，SDS-PAGE分離。320 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的Fyn、Nrf2、HO-1、NQO1和GAPDH一抗4℃ 孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入二抗置搖床上室溫孵育1 h，采用ECL發(fā)光后膠片暗室曝光顯影。用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1穩(wěn)斑湯改善CMD大鼠冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙 HE染色觀察心肌病理組織學(xué)變化。假手術(shù)組心肌纖維排列良好，心肌細(xì)胞大小均勻，胞質(zhì)染色均勻，血管壁正常，微血管無血栓形成。而模型組可見心肌細(xì)胞肥大、排列不規(guī)則、胞質(zhì)不均一、核固縮、核溶解、血管壁增厚、微血管血栓形成。經(jīng)穩(wěn)斑湯處理后，大鼠心肌纖維排列較良好，心肌細(xì)胞肥大情況得到改善，胞質(zhì)染色較均勻，血管壁增厚程度變輕，微血管中雖有血栓形成，但均得到一定程度的改善。見圖1。

圖1 各組心肌病理組織學(xué)(HE，×200)

2.2穩(wěn)斑湯改善CMD大鼠的血管活性 與假手術(shù)組相比，模型組血清中PGI2含量顯著升高，而TXA2含量顯著降低(P<0.05)；給予穩(wěn)斑湯治療后的CMD大鼠血清中PGI2含量顯著降低，而TXA2含量顯著升高(P<0.05)，見表1。說明穩(wěn)斑湯能改善CMD大鼠冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙的血管活性。

表1 各組血清中PGI2和TXA2水平比較

2.3穩(wěn)斑湯減輕大鼠冠脈微循環(huán)障礙內(nèi)皮的損傷 與假手術(shù)組相比，CMD大鼠左心室中TM和EPCR mRNA水平均顯著升高(P<0.05)；而經(jīng)穩(wěn)斑湯治療后，CMD大鼠心臟區(qū)內(nèi)皮損傷相關(guān)因子TM和EPCR mRNA水平明顯降低(P<0.05)，說明穩(wěn)斑湯能夠減輕CMD大鼠的內(nèi)皮損傷。見表2。

表2 qPCR檢測(cè)各組TM、EPCR mRNA的表達(dá)

2.4穩(wěn)斑湯減輕CMD大鼠心臟中氧化應(yīng)激水平 與假手術(shù)組相比，模型組SOD、CAT和 GSH活性明顯降低，而MDA含量顯著提高(P<0.05)；與模型組相比，穩(wěn)斑湯治療組能夠顯著提高損傷心組織中SOD、CAT和 GSH活性(P<0.05)，顯著降低MDA含量(P<0.05)，見表3。說明穩(wěn)斑湯能夠減輕CMD所致的氧化應(yīng)激。

表3 各組心臟MDA、SOD、CAT、GSH、CAT、Fyn、Nrf2、HO-1及NQO1水平比較

2.5穩(wěn)斑湯抑制CMD大鼠心臟中NRF2信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組Fyn水平明顯升高，Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，穩(wěn)斑湯組能降低Fyn的表達(dá)，Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，見表3、圖2。提示穩(wěn)斑湯抑制Fyn進(jìn)而激活NRF2信號(hào)通路通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮心保護(hù)作用。

圖2 各組左心室中Fyn、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白的成像條帶

3 討 論

CMD在我國醫(yī)學(xué)上雖然沒有明確的命名，但是根據(jù)其發(fā)病時(shí)的特征，可將其歸于胸痹和心痛癥的范疇，臨床上通過溫陽活血、疏肝化痰的方法可治療CMD?！督饏T要略》首次提到“陽微陰弦”，說明發(fā)病的先決條件是胸陽不振和氣血痹阻?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在前人的總結(jié)上提出了CMD的主要發(fā)病機(jī)制為心絡(luò)絀急、陽虛絡(luò)瘀、肝郁氣滯等，所以CMD主要治療原則是活血通絡(luò)、益氣散結(jié)、疏肝化痰。中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯主要功效則是搜風(fēng)祛痰、活血化瘀，方中運(yùn)用了搜風(fēng)中藥蜈蚣、全蝎、水蛭、地龍，配合化痰化瘀藥法半夏、陳皮、白術(shù)。藥理研究顯示：蜈蚣可以降低血液黏度，使凝血時(shí)間延長，改善微循環(huán)；全蝎具有抗凝功能，起到抑制形成的功效；水蛭同全蝎一樣具有抗凝功能，同時(shí)還降低血脂，消退粥樣斑塊；地龍可以發(fā)揮抗凝和纖溶功能；法半夏具有降脂作用；陳皮可擴(kuò)張血管、增加血流量、增加心肌收縮力，同時(shí)還能降低血脂；白術(shù)可改善心肌缺血缺氧癥狀，也有抗凝作用〔7，10〕。本研究結(jié)果說明穩(wěn)斑湯可以改善冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙。

CMD可導(dǎo)致心臟缺血和心臟病發(fā)作。梗阻性冠脈疾病與CMD的主要區(qū)別是誘導(dǎo)的病因。梗阻性冠脈疾病主要由冠脈斑塊的形成和導(dǎo)致缺血的血管阻塞或狹窄引起的，而CMD是由毛細(xì)血管丟失或小血管收縮增加引起的。由于CMD引起的胸痛患者的血管影像是正常的，因此CMD患者常被誤診為心肌炎等其他疾病〔11〕。PGI2和TXA2是維護(hù)血管張力、血管壁完整性等方面起著重要作用的因子，其他因素導(dǎo)致兩者失衡會(huì)引起血管疾?。籘M及EPCR是新發(fā)現(xiàn)的位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的兩種蛋白受體，用來反映內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志。創(chuàng)傷后氧化應(yīng)激及炎癥的發(fā)生直接或間接導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮細(xì)胞大量釋放TM及EPCR〔12〕。本研究結(jié)果說明穩(wěn)斑湯能改善CMD大鼠冠脈微循環(huán)障礙的血管活性，減輕血管內(nèi)皮損傷。

CMD發(fā)生時(shí)氧自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌氧化損傷。氧自由基可引起組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生MDA，體內(nèi)存在的天然的自由基清除系統(tǒng)如SOD、GSH等也會(huì)被消耗而降低。本研究結(jié)果說明穩(wěn)斑湯能夠減輕CMD所致的氧化應(yīng)激。Nrf2是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性的中心調(diào)節(jié)因子。在正常條件下，細(xì)胞內(nèi)NRF2以低水平表達(dá)，主要通過泛素化和蛋白酶體降解被Fyn抑制。在活化后，Nrf2與Fyn解離，并與各種抗氧化應(yīng)激應(yīng)答基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，如NADPH、NQO1、HO-1和NQO1，與核內(nèi)的抗氧化應(yīng)答元件(WAS)結(jié)合。這些酶通常通過減少過量ROS和防止細(xì)胞氧化損傷來維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)〔13〕。因此，Nrf2信號(hào)通路在抗氧化應(yīng)激中起著重要的作用。本研究結(jié)果證實(shí)穩(wěn)斑湯可以抑制Fyn進(jìn)而激活NRF2信號(hào)通路通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用。