miR-424介導(dǎo)的VEGFA低表達(dá)阻礙宮頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移

萬(wàn)紅英 王芬 張戈 俞茜 鮑夢(mèng)欣

(1上饒市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 上饒 334000；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科)

宮頸癌是全世界女性中僅次于乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌的第四大癌癥〔1〕。宮頸癌主要是由高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)基因型感染引起的〔2〕。隨著宮頸癌篩查和預(yù)防的發(fā)展，如HPV聯(lián)合檢測(cè)和HPV疫苗接種，宮頸發(fā)育異常和癌癥的早期診斷程序可降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率〔3〕。目前，對(duì)于宮頸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療指南是放療聯(lián)合順鉑類化療，不幸的是，這些患者在最初的5年中有較高的復(fù)發(fā)率和較差的生存率〔4〕。大量的miR已被確定在各種腫瘤細(xì)胞生物過(guò)程中有重要作用，如細(xì)胞增殖、周期調(diào)控、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡〔5〕。異常的miR表達(dá)參與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展，因此MicR有作為宮頸癌生物標(biāo)志物的潛力〔6〕。已有研究表明miR-424對(duì)宮頸癌的診斷和預(yù)后有提示作用，抑制宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)〔7〕。但miR-424對(duì)宮頸癌的具體作用機(jī)制尚未見報(bào)道，本研究旨在探討miR-424介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)A低表達(dá)對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 6只雄性SPF級(jí)別裸鼠，4～6周齡，體重(16±2)g，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(贛)2018-0003。DMEM培養(yǎng)基(12100-046)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057 )和青-鏈霉素(15140-122)均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司；CCK-8試劑盒(C0037)、LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑(C0535)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012S)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell(3374)購(gòu)自美國(guó)Corning公司；熒光素酶(L7840)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司；anti VEGFA(ab46154)、Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、E-cadherin(ab15148)、N-cadherin(ab18203)、Vimentin(ab137321)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2裸鼠移植瘤模型的建立〔8〕取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SiHa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞為1×107個(gè)/ml，0.2 ml/只注射于裸鼠后背部靠近腋窩處皮下。達(dá)成瘤標(biāo)準(zhǔn) (負(fù)荷瘤瘤徑≥0.5 cm) 后將裸鼠隨機(jī)分為兩組：Scramble組和miR-424 agomir組。miR-424 agomir組第8天后開始注射miR-424 agomir，1次/4 d，每次1 nmol/L。

1.3腫瘤體積和重量 常規(guī)飼養(yǎng)接種腫瘤細(xì)胞的裸鼠30天，切除腫瘤，用10%甲醛固定，計(jì)算腫瘤體積。模型建立30 d后，切下腫瘤，稱取各組裸鼠的腫瘤重量。

1.4方法

1.4.1qPCR 用Trizol法從各組SiHa細(xì)胞中提取總RNA，培養(yǎng)于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，根據(jù)qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件為：95℃ 2 min，95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s。miR-424以U6為內(nèi)參，VEGFA以GAPDH為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量計(jì)算。

1.4.2免疫組化 取各組裸鼠腫瘤組織，常規(guī)石蠟包埋制成厚度約4 μm的切片，按免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行免疫組化染色，陽(yáng)性表達(dá)為胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用光學(xué)顯微鏡觀察Ki67和VEGFA在腫瘤組織中的表達(dá)情況。

1.4.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 正常宮頸細(xì)胞系Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞系Hela、C33A、SiHa購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1 %青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基，收集細(xì)胞時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，試驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。miR-424 mimic組采用LipoRNAiTM轉(zhuǎn)染試劑將miR-424 mimic轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，LV-VEGFA轉(zhuǎn)染LV-VEGFA載體，miR-424+VEGFA組同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-424 mimic和LV-VEGFA載體。

1.4.4熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將NC-mimic、miR-424 mimic轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，將細(xì)胞分為3組：Control組、NC-mimic組和miR-424 mimic組，檢測(cè)miR-424過(guò)表達(dá)情況。將LV-NC、LV-VEGFA轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，將細(xì)胞分為3組：Control組、LV-NC組和LV-VEGFA組，檢測(cè)VEGFA過(guò)表達(dá)情況。通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)顯示VEGFA是miR-424-5p的潛在靶點(diǎn)，選用熒光素酶報(bào)告分析，構(gòu)建野生型(Wt)和突變型(Mut)VEGFA 3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，將細(xì)胞分為4組：VEGFA Wt組、VEGFA Wt+miR-424-5p mimic組、VEGFA Mut組和VEGFA Mut+miR-424-5p mimic組，采用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

1.4.5CCK-8 將SW480細(xì)胞接種于96孔板(100 μl/孔)孵育24 h后，按方法1.4.3分組處理各組細(xì)胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育96 h，在450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

1.4.6克隆形成法 將SiHa細(xì)胞接種至6孔板，約500個(gè)細(xì)胞每孔，按方法1.4.3進(jìn)行處理及分組，培養(yǎng)7 d后棄掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗凈干燥后于顯微鏡下觀察克隆形成數(shù)目，計(jì)算克隆形成率。細(xì)胞克隆形成率(%)=細(xì)胞克隆總數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.7Transwell 取無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的人工基底膜，加入Transwell上室，37℃風(fēng)干。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，按方法1.4.3處理分組。上室中加入200 μl的細(xì)胞懸液，下室中加500 μl的含血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h，棉簽擦去基質(zhì)膠和上室細(xì)胞，多聚甲醛固定后染色。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野。

1.4.8劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移 將各組細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入6孔板中。過(guò)夜培養(yǎng)至單層細(xì)胞。然后在單層細(xì)胞上用10 μl的槍頭劃?rùn)M線，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去脫落細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后取出拍照測(cè)量劃痕寬度，劃痕愈合率0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度0 h劃痕寬度。

1.4.9Western印跡 各組細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。4℃下加入VEGFA、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入電化學(xué)發(fā)光顯色液顯色。以GAPDH為內(nèi)參，ImageJ軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白與GAPDH比值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-424抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng) 第20天，第25天，第30天miR-424 agomir組腫瘤體積〔(145.15±56.12),(265.57±137.38),(637.54±183.38)mm3〕均顯著低于scramble組〔(654.86±80.18),(1 233.43±124.24),(2 592.55±213.67)mm3,均P<0.05〕。30 d后，miR-424 agomir組腫瘤重量〔0.38±0.08)g〕顯著低于Scramble組〔(0.82±0.13)g,P<0.05〕；miR-424 agomir組miR-424表達(dá)水平(0.16±0.05)顯著低于Scramble組(1.28±0.14，P<0.01)；miR-424 agomir組Ki67、VEGFA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目〔(7.38±3.05)個(gè)、(4.15±1.02)個(gè)〕顯著低于Scramble組〔(45.03±2.41)個(gè)、(32.33±1.81)個(gè),P<0.01〕。見圖1，圖2。

圖1 miR-424對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

圖2 免疫組化檢測(cè)Ki67和VEGFA表達(dá)(DAB，×200)

2.2miR-424與VEGFA靶向關(guān)系 與Ect1/E6E7組比較，SiHa組、Hela組、C33A組miR-424水平均顯著降低，而VEGFA水平均顯著升高(均P<0.05)。以SiHa組變化最顯著。見表1。通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)得到VEGFA的3′-UTR有miR-424-5p的結(jié)合位點(diǎn)，提示VEGFA與miR-424-5p存在靶向作用關(guān)系。見圖3。VEGFA Wt組熒光素酶活性(3.11±0.16)顯著高于VEGFA Wt+miR-424-5p mimic組(2.02±0.37，P<0.05)；Control組miR-424表達(dá)水平(1.00±0.10)顯著低于miR-424 mimic組(43.56±2.27，P<0.001)；Control組VEGFA表達(dá)水平(1.00±0.15)顯著低于LV-VEGFA組(5.37±0.83，P<0.01)；與Control組VEGFA蛋白水平(1.00±0.18)比較，miR-424 mimic組(0.11±0.06)顯著降低(P<0.05)，LV-VEGFA組(5.37±1.01)顯著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA組VEGFA蛋白水平(0.73±0.26)顯著低于LV-VEGFA組(P<0.05)。見圖4。

表1 不同宮頸癌細(xì)胞系中miR-424、VEGFA表達(dá)水平比較

圖3 Targetscan預(yù)測(cè)VEGFA與miR-424-5p靶向關(guān)系

1～4：Control組、miR-424 mimic組、LV-VEGFA組、miR-424+VEGFA組；圖6、9同圖4 Western印跡檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞VEGFA蛋白表達(dá)水平

2.3miR-424介導(dǎo)VEGFA低表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞增殖倍數(shù)均有時(shí)間依賴性(均P<0.05)。第1天，與Control組比較，miR-424 mimic組細(xì)胞增殖信數(shù)顯著下降(P<0.05)。第2～4天，與Control組比較，miR-424 mimic組細(xì)胞增殖倍數(shù)均顯著下降(均P<0.05)；LV-VEGFA組細(xì)胞增殖倍數(shù)均顯著上升(均P<0.05)；miR-424+VEGFA組細(xì)胞增殖倍數(shù)均顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見表2,圖5。與Control組比較，miR-424 mimic組克隆形成率顯著下降(均P<0.05)；LV-VEGFA組顯著上升(均P<0.05)；miR-424+VEGFA組克隆形成率顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見表3。與Control組Ki67、PCNA蛋白水平比較，miR-424 mimic組均顯著降低(均P<0.05)，LV-VEGFA組均顯著升高(均P<0.05)，miR-424+VEGFA組Ki67、PCNA蛋白水平均顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見表3，圖6。

表2 各組SiHa細(xì)胞細(xì)胞增殖倍數(shù)比較

圖5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞克隆形成率(結(jié)晶紫染色，×200)

表3 各組SiHa細(xì)胞克隆形成率和Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平比較

圖6 Western印跡檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)

2.4miR-424介導(dǎo)VEGFA低表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲和遷移 與Control組比較，miR-424 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)，LV-VEGFA組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。與Control組比較，miR-424 mimic組細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.01)，LV-VEGFA組細(xì)胞遷移率顯著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA組細(xì)胞遷移率顯著低于LV-VEGFA組(均P<0.05)。見圖7、圖8、表4。

圖7 Transwell檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)(結(jié)晶紫染色，×200)

圖8 劃痕法檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞劃痕愈合率(×200)

表4 各組SiHa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率比較

2.5miR-424介導(dǎo)VEGFA低表達(dá)抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞EMT 與Control組相比較，miR-424 mimic組E-cadherin蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)，LV-VEGFA組E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，miR-424+VEGFA組E-cadherin蛋白水平顯著高于LV-VEGFA組(P<0.05)，LV-VEGFA組N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著高于miR-424+VEGFA組(均P<0.05)，見圖9，表5。顯微鏡下觀察Control組較其他組上皮細(xì)胞有極性，細(xì)胞呈紡錘狀，長(zhǎng)出游離的絲狀偽足，細(xì)胞排列疏松，失去細(xì)胞間的黏附力，細(xì)胞由上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)生了典型的EMT形態(tài)變化，見圖10。

圖9 Western印跡檢測(cè)各組SiHa細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平

表5 各組SiHa細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平比較

圖10 各組SiHa細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)變化(免疫熒光，×200)

3 討 論

宮頸癌是全世界女性中第四大最常見的腫瘤類型和第四大癌癥死因〔9〕。miR-424-5p由miR-424前體5′端臂加工而成，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)存在差異，如在胰腺癌、舌鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在肺癌、肝癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，有促癌或抑癌雙重作用〔10〕。

VEGFA是一種糖基化的有絲分裂原，專門作用于內(nèi)皮細(xì)胞，有多種作用，包括血管生成〔11〕。研究表明VEGF是腫瘤生長(zhǎng)的正調(diào)節(jié)劑，可促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡〔12〕。Tao等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)miR-144通過(guò)直接靶向VEGFA和VEGFC對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)提示miR-424通過(guò)調(diào)控VEGFA的表達(dá)影響血管生成。

癌細(xì)胞過(guò)度增殖是宮頸癌病灶內(nèi)重要的生物學(xué)特征，即抑制癌細(xì)胞增殖是治療宮頸癌的必要方式。Ki67是存在于細(xì)胞增殖期的蛋白質(zhì)，位于10號(hào)染色體上，與細(xì)胞增殖有關(guān)，在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)〔14〕。PCNA是與細(xì)胞增殖周期相關(guān)的周期蛋白，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)PCNA是研究腫瘤細(xì)胞增殖活性的常用方法，表達(dá)強(qiáng)意味著腫瘤細(xì)胞處于增殖期〔15〕。本研究表明miR-424抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖。

超過(guò)90%的癌癥相關(guān)死亡率是由遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而不是原發(fā)腫瘤引起的，癌癥轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要許多分子和細(xì)胞事件。判斷腫瘤是否惡性與腫瘤細(xì)胞的侵襲程度相關(guān)。研究表明miR-424-5p參與腫瘤的侵襲和遷移，Wang等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5p可通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)SMAD7參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而參與食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Wu等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)miR-424-5p表達(dá)上調(diào)可增加胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。本研究提示miR-424可抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，在這個(gè)過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去其特有的形態(tài)和功能特性，從而更接近間充質(zhì)細(xì)胞，黏附特性和運(yùn)動(dòng)性發(fā)生改變〔18〕。EMT表型的普遍特征是在腫瘤發(fā)生過(guò)程中E-cadherin的功能喪失和N-cadherin、Vimentin過(guò)表達(dá)〔19〕。Zhang等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-424-5p直接靶向抑制β-連環(huán)蛋白/T細(xì)胞因子抑制子，維持細(xì)胞膜上E-cadherin/β-catenin復(fù)合物，可逆轉(zhuǎn)失巢凋亡抵抗、阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制遷移活性。本研究提示miR-424具有抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞EMT的作用。

綜上，miR-424可抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)，介導(dǎo)VEGFA低表達(dá)可抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT。