以多參數(shù)Logistic回歸模型分析循環(huán)微小RNA與AMI病情及預(yù)后的關(guān)系

吳新建 鐘永富

(重慶三峽中心醫(yī)院急救部，重慶 404000)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠狀動(dòng)脈的血管壁易損斑塊發(fā)生破裂，有繼發(fā)血栓形成及炎性反應(yīng)參與的急危重癥，具有極高的病死率〔1〕。因此，及時(shí)有效診斷AMI是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前，雖然以肌鈣蛋白作為代表的心肌損傷標(biāo)志物在AMI的診斷和預(yù)后中具有重要作用，但其準(zhǔn)確性并不高，且在多種心血管疾病中肌鈣蛋白(cTn)同樣會(huì)增加〔2〕。因此，找到敏感性和特異性強(qiáng)的標(biāo)志物，以彌補(bǔ)cTn在AMI診斷中的缺陷非常重要〔3〕。微小RNA(miRNA)作為近些年發(fā)現(xiàn)的一類能夠在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)機(jī)體基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控的非編碼小RNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因的3′非翻譯區(qū)進(jìn)行結(jié)合進(jìn)而抑制基因的翻譯，在炎癥反應(yīng)、發(fā)育和代謝及腫瘤形成等生理過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用〔4〕。研究表明，大腦存在某些特定的miRNA，其表達(dá)水平和神經(jīng)功能紊亂密切相關(guān)，在腦部發(fā)生缺血后腦內(nèi)一些基因被誘導(dǎo)或抑制，可能與miRNA引起mRNA的降解和翻譯過程有關(guān)〔5〕。另外，血漿中微小RNA在AMI的發(fā)生和發(fā)展過程中異常表達(dá)，可作為AMI的潛在標(biāo)志物〔6〕。因此，本研究旨在探討循環(huán)微小RNA與AMI病情及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2019年1月在重慶三峽中心醫(yī)院進(jìn)行治療且診斷為AMI的患者80例作為研究組。男50例，女30例；年齡40～79〔平均(63.15±4.68)〕歲。另外，選擇60例經(jīng)冠狀造影檢查陰性的患者作為對(duì)照組，男36例，女24例，年齡40～78〔平均(60.98±4.41)〕歲。3組年齡及性別等一般資料差異均為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。所有入組人員簽署知情同意書，且該研究方案通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①患者均持續(xù)胸痛達(dá)30 min以上；②AMI患者的心肌損傷標(biāo)志物高于參考區(qū)間的上限，其中血清cTnI>0.06 ng/ml或者肌酸激酶同工酶(CK-MB)>16 IU/L；③心電圖顯示患者具有連續(xù)兩個(gè)及以上導(dǎo)致典型心肌缺血的改變；④冠狀動(dòng)脈造影顯示明確的血管病變排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者為陳舊性心肌梗死；②患者具有心臟病史，例如心肌炎、心臟瓣膜病和心源性休克等；③合并患有惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全者及甲狀腺功能異常者。

1.3試劑盒儀器 總RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Trizol公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購(gòu)自Ambion公司；QuantiTect SYBR Green PCR Kit購(gòu)自Qiagen公司；PCR引物購(gòu)自金斯瑞公司；cTnI ELISA檢測(cè)試劑盒及肌紅蛋白(MB)ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；膽固醇(TC)檢測(cè)試劑盒、三酰甘油(TG)試劑盒、CK-MB均購(gòu)自英國(guó)Randox公司；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均購(gòu)自日本第一化學(xué)株式會(huì)社公司。普通PCR儀及電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自BIO-RAD公司；NanoDrop 2000c購(gòu)自Thermo公司；離心機(jī)及恒溫水浴箱均購(gòu)自BIO-RAD公司；熒光定量PCR儀及E601電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀均購(gòu)自Roche公司；AIA-2000全自動(dòng)免疫發(fā)光分析儀均購(gòu)自日本東曹公司。

1.4研究方法〔7〕經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)均由2名以上具有豐富經(jīng)驗(yàn)的心血管內(nèi)科醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)。以3條心外膜下冠狀動(dòng)脈和大分支任意段直徑狹窄≥50%作為冠狀動(dòng)脈造影陽(yáng)性，并按照狹窄所累及的血管，分為左主干、左回旋支、左前降支、右冠狀動(dòng)脈分為單支血管病變、二支血管病變和三支血管病變，單純的左主干病計(jì)為二支病變?；颊呔?jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)，PCI術(shù)前AMI患者冠狀動(dòng)脈主要分支狹窄均≥70%，且PCI術(shù)后其相應(yīng)分支殘余狹窄程度≤20%。另外，心肌梗死溶栓(TIMI)的血流分級(jí)≥2；患者術(shù)后均采用標(biāo)準(zhǔn)藥物進(jìn)行治療?；颊呔诰驮\2 h內(nèi)抽取外周靜脈血4 ml；對(duì)照組均于造成空腹?fàn)顟B(tài)下采取外周靜脈血4 ml。均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，且顛倒搖勻，后凍存于-80℃冰箱待用。按照Triol試劑盒說明書抽取患者的外周血標(biāo)本總RNA。抽提結(jié)果運(yùn)用NanoDrop2000c紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA進(jìn)行定量，之后運(yùn)用1 μg的總RNA按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)而合成cDNA，后凍存于-80℃待用。熒光定量PCR反應(yīng)參照QuantiTect SYBR Green PCR Kit試劑盒的說明書，且以合成的cDNA作為模板在PCR儀上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系20 μl，體系如下：cDNA 1 μl；上游引物和下游引物各2 μl；2*SYBR premix Ex TagTM II PCR 7 μl；Rnase-free water 9 μl。反應(yīng)條件如下：95℃ 10 min；95℃ 10 s；65℃ 30 s；72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)以U6作為內(nèi)參對(duì)照，運(yùn)用CT值法比較分析各組miRNA的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用7300PCR軟件對(duì)熒光定量PCR儀采集的信號(hào)進(jìn)行分析，觀察引物以及目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線。采用2-△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，計(jì)算各組miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5生化指標(biāo)檢測(cè) 患者的血清生化指標(biāo)均按照相應(yīng)自動(dòng)化分析儀以及試劑盒的說明說進(jìn)行操作，其中TC采用膽固醇氧化酶法，TG運(yùn)用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)法，HDL-C和LDL-C運(yùn)用間接法，運(yùn)用酶耦聯(lián)法檢測(cè)CK，免疫抑制-酶動(dòng)力法檢測(cè)CK-MB，cTnI和NT-pro-BNP采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析、Logistic回歸分析、受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1兩組血脂及心功能指標(biāo)水平比較 與對(duì)照組比較，AMI組治療前血清TG水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)。與治療前相比，AMI組治療后TG、cTnI、NT-pro-BNP、CK、CK-MB顯著升高(P<0.05)，TC、GRACE評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血脂及心功能指標(biāo)水平比較〔M(Q25,Q75〕

2.2兩組治療前血清miRNA水平比較 AMI組血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

續(xù)表1 兩組血脂及心功能指標(biāo)水平比較〔M(Q25,Q75〕

2.3AMI患者治療前后miRNAs水平比較 治療后，AMI患者血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均較治療前顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清miRNAs水平比較

2.4血清miRNAs水平對(duì)AMI病情的監(jiān)測(cè)價(jià)值 血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210用于監(jiān)測(cè)AMI組和對(duì)照組ROC曲線下面積(AUC)分別為0.73(95%CI=0.63～0.82，P<0.001)、0.66(95%CI=0.55～0.76，P<0.001)、0.71(95%CI=0.61～0.81，P<0.001)、0.75(95%CI=0.61～0.83，P<0.001)、0.72(95%CI=0.57～0.79，P<0.001)。

以AMI和對(duì)照組的二類變量作為因變量，以血清mRNAs水平、性別、年齡及血脂指標(biāo)(包括TC、TG、HDL-C、LDL-C)作為自變量，單因素僅納入miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平。結(jié)果提示，miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平均于AMI的發(fā)生具有相關(guān)性。而多因素模型中除了納入miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平外，還納入年齡、性別及血脂水平，結(jié)果提示：通過矯正性別、年齡及血脂水平，高水平miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210仍然可作為AMI發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。見表3。

表3 血清miRNAs的單因素及多因素Logistic回歸分析

2.5血清miRNAs水平和患者臨床參數(shù)的相關(guān)性分析 AMI組治療前血清miR146a、miR193a、miR16和miR210水平和cTNI的水平及預(yù)后GRACE評(píng)分呈正相關(guān)；血清miR146a和miR16水平還與TG水平呈正相關(guān)，血清miR208b與NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)。見表4。

表4 血清miRNAs水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

AMI患者由于腦動(dòng)脈閉塞進(jìn)而導(dǎo)致腦組織缺血和缺氧，因此產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及血管再生等病理過程，且神經(jīng)功能障礙為主要臨床表現(xiàn)〔8〕。研究表明〔9,10〕，在患者缺血和缺氧狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的mRNAs水平發(fā)生變化，miRNA和低氧反應(yīng)具有密切關(guān)系，且多種miRNA參與機(jī)體的大腦缺血、缺氧及再灌注損傷中的細(xì)胞凋亡。miRNA通過調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡基因、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及細(xì)胞周期基因而發(fā)揮作用〔11〕。臨床研究表明〔12〕，AMI患者中多種血清及血漿RNAs特異性表達(dá)，可作為AMI早期診斷及病情預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，且AMI患者治療前后血清中特定miRNAs的水平同樣會(huì)發(fā)生特異性的改變，表明miRNAs還可以作為監(jiān)測(cè)AMI患者PCI 治療前后的病情變化的潛在標(biāo)志物。

機(jī)體在正常狀況下，血液中的一些miRNA處于穩(wěn)定狀態(tài)，因此其異常表達(dá)有助于疾病的診斷〔13〕。由于外周血的方便性及RNA提取的可操作性，使得人們能夠檢測(cè)miRNA水平來(lái)對(duì)某些疾病進(jìn)行早期診斷。本研究結(jié)果表明，血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平不僅與AMI的損傷程度呈正相關(guān)，同樣可作為PCI手術(shù)治療前后患者病情變化的新型標(biāo)志物。Zhu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者PCI 手術(shù)后血漿miR181a水平相較于治療前顯著下降。Chen等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，AMI患者術(shù)后miR499水平相較于手術(shù)前顯著降低，并且多支冠狀動(dòng)脈患者的miR499水平顯著高于單支冠狀動(dòng)脈病變的患者，與本文研究結(jié)果相一致。這是興奮性氨基酸細(xì)胞毒性作用機(jī)制是腦缺血損傷的病理生理過程的重要環(huán)節(jié)，在急性腦梗死發(fā)生后，在缺血區(qū)突觸間隙存在大量谷氨酸聚集，最終引起神經(jīng)元損傷從而造成廣泛的的腦組織病理性損害〔16〕。而GLT-1作為一種興奮性氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的亞型，是主要的星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，其編碼基因?yàn)镾LClA2。在腦梗死后，患者腦組織的miRNAs水平表達(dá)升高，并與編碼基因SLClA2的mRNA 3′UTR結(jié)合，下調(diào)mRNA表達(dá)，抑制GLT-1蛋白的表達(dá)，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，促進(jìn)神經(jīng)元損傷〔16〕。

本研究結(jié)果表明，miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平可作為AMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中，miR146a通過機(jī)體炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展〔17〕；miR193a-5p可通過促進(jìn)心臟病患者的心臟微血管的生產(chǎn)〔18〕；miR16在多種癌癥及心血管疾病中起重要作用，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔19〕；miRNA210在促進(jìn)腦血管缺血后血管新生過程中起到重要作用〔20〕。因此，監(jiān)測(cè)AMI患者血清中miR146a、miR193a、miR208b、miR16和miR210水平能有效評(píng)估AMI患者疾病嚴(yán)重程度及PCI術(shù)后患者的病情變化。