石蒜堿抑制胃癌細胞系MGC-803增殖、遷移和侵襲

鮑美美，徐 雯，王 超，王 佳，苗小芬*

(1.蘇州大學 物理科學與技術(shù)學院，江蘇 蘇州 215006；2.南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 病理科，江蘇 蘇州 215009)

胃癌(gastric cancer)是全世界第五大惡性腫瘤，起源于胃黏膜上皮，全世界每年約有100萬人死于該病，這導致了巨大的生態(tài)和公共健康負擔[1]。近年來，隨著新的診斷和治療策略的發(fā)展，胃癌的發(fā)病率和病死率正穩(wěn)步下降。然而，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)，胃癌患者的總體5年生存率仍然低于29%[2]。

鹽酸石蒜堿(lycorine hydrochloride，LH)是石蒜科植物中廣泛存在的一種具有藥理活性的生物堿。越來越多的證據(jù)表明植物來源的LH具有多種藥理作用，如抗病毒、抗菌、抗寄生蟲、抗感染和抗腫瘤作用[3]。LH多種功能的分子機制包括誘導細胞凋亡，抑制細胞周期進展和自噬等[4]。目前已有證據(jù)表明LH對正常細胞的毒性很低，并且對腫瘤細胞的治療作用強于正常細胞[5]，然而關(guān)于LH在胃癌中的應用鮮有報道。

microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、單鏈、小的非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，在進化中高度保守，能夠在3′端非翻譯區(qū)與靶信使RNA(mRNA)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的表達[6]。miR-203是一種皮膚特異性miRNA，除參與表皮構(gòu)成外，亦可作為腫瘤抑制因子或致癌基因參與多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[7]。研究顯示miR-203在結(jié)直腸癌中低表達并且抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖[8]。miR-203可通過靶向毛細血管擴張突變激酶ATM抑制胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。大量證據(jù)表明，miR-203通過靶向Slug調(diào)節(jié)癌的起始和發(fā)展。

本研究探討LH對人胃癌細胞MGC-803細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并分析其作用機制，為其作為抗癌藥物的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人胃癌細胞系MGC-803為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑：鹽酸石蒜堿(成都曼思特生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(CLARK公司)；瑞氏-姬姆薩染液(南京建成科技有限公司)；MTT染液、Trizol(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；RNA酶、PI染液(Sigma Aldrich公司)；RT-qPCR試劑(Vazyme公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)：用含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)MGC-803細胞，每2～3 d按1∶3的比例傳代1次。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性：取對數(shù)增殖期的人胃癌細胞MGC-803，以每孔3×103個細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度LH的培養(yǎng)基，對照組含細胞和培養(yǎng)基，空白組含培養(yǎng)基，每組設置6個復孔，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24及48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO溶液于搖床避光低速振蕩10 min，待結(jié)晶全部溶解后在酶標儀上測定490 nm處的吸光度，實驗獨立重復3次。細胞增殖抑制率/%=[1-(A給藥組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%

1.2.3 集落形成實驗檢測細胞的增殖能力：將不同濃度的LH作用胃癌MGC-803細胞48 h，消化后以1×103個/孔接種于6孔板內(nèi)，十字法使其均勻分布，待細胞貼壁3 d后換成新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每3天更換1次培養(yǎng)基。當培養(yǎng)基中出現(xiàn)肉眼可見克隆且顯微鏡下單個集落細胞計數(shù)大于50時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞10 min，用瑞氏-姬姆薩染液進行染色，去離子水洗凈風干后倒置顯微鏡拍照觀察計數(shù)，實驗獨立重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期：用不同濃度的LH處理胃癌MGC-803細胞48 h后，收集細胞，PBS洗滌2次，再用70%冰乙醇于4 ℃進行固定過夜。離心洗滌后，用預冷的PBS進行重懸，加入5 μL 10 mg/mL RNase A，37 ℃避光處理30 min，再用50 μg/mL的PI于4 ℃避光處理30 min，最后利用流式細胞儀檢測細胞周期分布，實驗獨立重復3次。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移：取對數(shù)增殖期的胃癌MGC-803細胞接種于6孔板中，待細胞匯合達到80%左右時，用黃色槍尖在每個孔內(nèi)豎直劃痕，PBS清洗3遍后加入含不同濃度LH的低血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24 及48 h分別用瑞氏-姬姆薩染液進行染色拍照，記錄各組細胞劃痕寬度，實驗獨立重復3次。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞侵襲：將無血清DMEM培養(yǎng)基和Matrigel基質(zhì)膠以1∶7比例稀釋后置于冰上，取25 μL加入Transwell上室膜上鋪平，37 ℃培養(yǎng)箱靜置30 min待其凝固，使用前先用無血清培養(yǎng)基浸潤上室膜。將LH作用48 h后的胃癌MGC-803細胞消化離心，用無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，在上室中分別加入1×105個細胞，下室加入DMEM完全培養(yǎng)基。孵育24 h后，用棉簽擦去膜上層未遷移的細胞，取出膜后用PBS洗3次，瑞氏-姬姆薩染液染色，風干后用中性樹脂封片顯微鏡拍照，實驗獨立重復3次。

1.2.7 RT-qPCR檢測相關(guān)基因的表達：收集LH作用48 h的胃癌MGC-803細胞樣品，用Trizol 冰上裂解10 min，利用氯仿提取RNA并溶解在DEPC水中。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄測定以合成cDNA。用SYBR實時PCR試劑盒進行RT-qPCR實驗。所有引物均獲自Genewiz公司，使用2-ΔΔCt法分析mRNA表達。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Fig 1 PCR primer sequence

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LH對MGC-803胃癌細胞活性的影響

與對照組相比，LH對MGC-803細胞增殖的抑制率隨著濃度增加呈遞增趨勢(P<0.05或P<0.01)，另外隨著作用時間的延長，抑制作用也顯著增強(圖1)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖1 MTT法檢測MGC-803 細胞活性的變化Fig 1 MTT assay for the changes of MGC-803 cell activity

2.2 LH對MGC-803胃癌細胞集落形成能力的影響

與對照組相比，LH作用后細胞形成的集落數(shù)量明顯減少，體積也隨之減小(P<0.01)，且呈濃度依賴性，當LH濃度達到20 μmol/L時幾乎沒有單克隆形成(表2)。

表2 各組MGC-803細胞克隆形成數(shù)目的比較Table 2 Comparison of the number of colony formation of MGC-803 cells in each n=3)

2.3 LH對胃癌MGC-803細胞周期的影響

隨著LH濃度的增加，G0/G1期細胞所占百分率逐漸降低，S期細胞所占百分率逐漸升高，而G2期分布比例變化不大(圖2，表3)。

表3 各組細胞周期分布的比較Table 3 Comparison of cell cycle distribution in each n=3)

圖2 流式細胞測量術(shù)檢測各組MGC-803細胞周期分布情況Fig 2 Flow cytometry assay for cell cycle distribution of MGC-803 cells

2.4 LH抑制胃癌MGC-803細胞的遷移

劃痕24 h后對照組已有部分細胞向劃痕處遷移，遷移比例為(60.37±1.40)%，48 h后細胞在劃痕處的遷移面積逐漸增大，遷移比例為87.17%±0.55%，劃痕傷口寬帶縮??；相比之下0.625 μmol/L組及2.5 μmol/L組細胞的遷移面積明顯小于對照組，24 h的遷移比例分別為39.70%±0.75%、35.80%±0.50%，遷移受到抑制，且48 h的抑制作用更為明顯，遷移比例分別為55.67%±0.65%、40.80%±1.40%(P<0.01)(圖3)。

圖3 劃痕實驗檢測各組MGC-803細胞遷移情況Fig 3 Wound healing assay for migration of MGC-803 cells

2.5 LH抑制人胃癌MGC-803細胞的侵襲

與對照組相比，給藥組穿膜細胞數(shù)明顯減少，當LH的濃度為1.25 μmol/L時細胞侵襲率為40%，而LH的濃度為2.5 μmol/L時細胞侵襲率僅為20%(P<0.01)(圖4)。

圖4 Transwell實驗檢測各組MGC-803細胞侵襲情況Fig 4 Transwell assay for invasion of MGC-803 cells

2.6 LH對人胃癌MGC-803細胞內(nèi)miR-203、Slug、MMP2和MMP9基因表達的影響

隨著LH濃度的升高，MGC-803細胞內(nèi)N-cadherin、vimentin、Zeb1和Snail的表達水平?jīng)]有明顯變化。Slug、MMP2和MMP9的表達水平顯著降低，而miR-203的表達水平顯著升高，其中5 μmol/L組的miR-203表達水平顯著高于對照組、1.25 μmol/L和2.5 μmol/L組，而Slug、MMP2和MMP9表達水平顯著低于對照組、1.25 μmol/L和2.5 μmol/L組(P<0.01)(表4～6)。

表4 各組MGC-803細胞內(nèi)N-cadherin、vimentin、Zeb1基因表達水平的比較Table 4 Comparison of N-cadherin,vimentin,Zeb1 gene expression levels in each group of MGC-803

表5 各組MGC-803細胞內(nèi)Snai1、MMP2、MMP9基因表達水平的比較Table 5 Comparison of Snai1,MMP2,MMP9 gene expression levels in each group of MGC-803

表6 各組MGC-803細胞內(nèi)Slug、miR-203基因表達水平的比較Table 6 Comparison of Slug,miR-203 gene expression levels in each group of MGC-803 cells

3 討論

miRNAs作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，已被廣泛報道參與多種生理和病理過程[10]。已有的研究證據(jù)表明，多種miRNAs在胃癌進展過程中異常表達，并介導多種靶基因調(diào)控細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。利用RT-qPCR檢測了多例胃癌樣本及配對的非癌樣本中miR-203的表達情況，結(jié)果顯示胃癌樣本中miR-203的表達顯著低于非癌樣本，且與胃癌晚期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miR-203的下調(diào)可能在胃癌的發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[11]。過表達miR-203顯著抑制胃癌細胞集落形成、細胞遷移及侵襲。本研究顯示LH能顯著升高MGC-803細胞內(nèi)miR-203的表達水平，從而抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

轉(zhuǎn)移是導致胃癌死亡率較高的主要原因。上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是與轉(zhuǎn)移進程有關(guān)的復雜生理過程，可使細胞間黏附喪失，細胞角蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，提高癌細胞的遷移和侵襲能力[12]。多種研究表明miRNAs參與該過程[13]。本研究將LH作用于胃癌細胞后，miR-203的表達顯著上升，而Slug的表達顯著降低，提示miR-203可能與Slug協(xié)同作用抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，可能是LH發(fā)揮抗胃癌的靶標分子。

基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs是選擇性調(diào)控腫瘤微環(huán)境促進腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因子，被認為是EMT過程中的誘導劑。在大部分腫瘤類型中，MMPs的表達水平都顯著升高，其中MMP2和MMP9是主要的蛋白水解酶，通過破壞基底膜，促進腫瘤細胞局部和遠處的浸潤，誘發(fā)腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。有研究表明MMP2和MMP9的血清學水平與胃癌組織的侵襲深度、癌細胞的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[14]。本研究顯示LH作用后MGC-803細胞內(nèi)MMP2和MMP9的表達水平下降，可能是由于抑制了細胞遷移和侵襲能力。

綜上所述，LH抑制MGC-803細胞增殖、遷移和侵襲，可能與上調(diào)miR-203的表達，下調(diào)Slug、MMP2及MMP9的表達相關(guān)。該研究表明低毒高效的LH對轉(zhuǎn)移性胃瘤的治療具有潛在的應用前景。