miR-146a減輕心肌缺血/再灌注損傷(MI/RI)大鼠的心肌細(xì)胞凋亡

鄭 新，于海波

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)三科，黑龍江 佳木斯 154002)

缺血性心臟病是一種全球性、對(duì)人類健康危害極大的心臟疾病。治療過(guò)程中血流急速再灌注導(dǎo)致心肌負(fù)荷過(guò)大在很大程度上損傷了心肌細(xì)胞，致使細(xì)胞凋亡數(shù)量大大增加造成組織損傷進(jìn)行性加重，此過(guò)程被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)[1]。研究顯示，在該病患者的血液中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌酶水平明顯升高[2]。Toll樣受體(TLR)4作為能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞因子活化的細(xì)胞受體有報(bào)道顯示其在心肌組織灌注受損時(shí)呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，可能介導(dǎo)了MI/RI的炎性反應(yīng)[3]。微小RNA(miRNA)是近些年發(fā)現(xiàn)的一種新的基因表達(dá)調(diào)節(jié)物，miR-146a定位于人類5號(hào)染色體，具有免疫調(diào)節(jié)作用[4]。然而目前關(guān)于miR-146a在MI/RI的作用效果及作用原理的相關(guān)研究未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠模擬MI/RI，探討miR-146a對(duì)該病大鼠的血清心肌酶譜、TLR4及心肌細(xì)胞凋亡作用的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SPF級(jí)SD大鼠36只，雄性，體質(zhì)量220～250 g，7～8周齡，實(shí)驗(yàn)室平均溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度60%，常規(guī)喂養(yǎng)(上海賽倫生物公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)20160071)。

1.1.2 試劑:烏拉坦(武漢卡布達(dá)公司)、一抗TLR4兔抗鼠抗體、TNF-α兔抗鼠抗體、NF-κB兔抗鼠抗體及二抗(武漢艾美捷公司)、TUNEL試劑盒(Roche公司)、PVDF膜(Millipore公司)；RT-qPCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)；cTnT檢測(cè)試劑盒、CK-MB檢測(cè)試劑盒(上海佰曄生物公司)和LDH檢測(cè)試劑盒(合肥萊爾生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠分為假手術(shù)組(sham)、模型組(model)、miR-146a NC組(結(jié)扎后轉(zhuǎn)染miR-146a-NC)、miR-146a agomir組(結(jié)扎后轉(zhuǎn)染miR-146a-a agomir)，均9只。各組大鼠分為建模方法參考[5]，采用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸器(60次/min)，潮氣量為13～15 mL，分離皮膚，于第4肋骨處開胸，從左側(cè)4肋間進(jìn)入胸腔，用7-0滑線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，然后解開結(jié)扎線恢復(fù)血管通暢，冠狀動(dòng)脈再灌注4 h后縫合胸腔，建立心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。假手術(shù)大鼠僅開胸后縫合。通過(guò)2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法評(píng)估各組大鼠心肌梗死面積。

1.2.2 TTC 染色觀察大鼠心肌梗死體積所占百分比：取大鼠心臟剔除周圍組織置入甲醛溶液中固定，保存在-80 ℃的環(huán)境下，5 min后將厚度為2 mm額極向后冠狀面儲(chǔ)存于1%濃度的TTC溶液中。在無(wú)光環(huán)境下37 ℃孵育，將心肌組織翻動(dòng)一次，5 min/次，成功染色后，正常心肌組織為紅色，梗死組織為白色，用專業(yè)圖像分析軟件處理并分析圖像，計(jì)算大鼠心肌梗死體積所占百分比。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)心肌組織中miR-146a、TLR4表達(dá)：取大鼠心肌組織，用Trizol進(jìn)行總RNA的提取并測(cè)定總RNA濃度、純度，反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行,將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA通過(guò)Eppendorf MAS熒光定量 PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增,內(nèi)參采用β-actin，目的基因的相對(duì)表達(dá)用2-△△Ct表示(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 心肌酶譜活性的檢測(cè)：多次采集眼眶全血6 mL，放置20 min(25 ℃)，2 000 r/min離心10 min，血清-70 ℃凍存。用比色法檢測(cè)血清cTnT、CK-MB和LDH活性。

1.2.5 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的觀察：心肌組織切片石蠟包埋，5 μm切邊，脫蠟10 min后利用95%乙醇水化，采用堿性蘇木精進(jìn)行染色15 min，PBS沖洗3次，蒸餾水清洗，再利用0.5伊紅染色3 min，PBS透明，HE染色并在顯微鏡下觀察心肌組織細(xì)胞病理狀態(tài)。

1.2.6 TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率：心肌組織進(jìn)行石蠟切片，2 μm的5張，按照TUNEL試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行TUNEL染色處理，胞核黃染為凋亡細(xì)胞。采用400倍光學(xué)顯微鏡在每一張切片選取5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行觀察并分別取凋亡細(xì)胞、細(xì)胞總數(shù)的均值。凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 Western blot測(cè)定心肌組織中TLR4蛋白的表達(dá)：取心肌組織100 mg，0.125%胰蛋白酶消化，離心取上清液。另取50 mg心肌組織提取核蛋白。Bradford法測(cè)蛋白濃度并將濃度調(diào)整為5 mg/L，取50 μL蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗1∶5 000(TLR4、TNF-α、NF-κB)后TTBS漂洗，間隔10 min,一共3次漂洗,最后加入二抗1∶1 000對(duì)溶液稀釋,封閉1 h(25 ℃)。取出PVDF膜吐溫Tris緩沖液每10 min清洗，共3次，DAB顯色后照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TTC染色檢測(cè)心肌梗死面積變化

假手術(shù)組、模型組、miR-146a-NC組及miR-146a agomir組心肌梗死面積分別為(2.56±0.50)%、(45.20±4.23)%、(43.05±3.69)%和(22.15±2.03)%，組間比較存在差異(P<0.05)。模型組與假手術(shù)組相比，心肌梗死區(qū)域(白色)面積增加(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組心肌梗死區(qū)域(白色)面積降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 4組心肌梗死面積變化Fig 1 Changes of myocardial infarction area in 4 groups

2.2 RT-qPCR檢測(cè)心肌組織大鼠miR-146a、TLR4 mRNA表達(dá)

模型組與假手術(shù)組相比miR-146a mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組miR-146a mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。模型組與假手術(shù)組相比，TLR4 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組TLR4 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group圖2 4組大鼠心肌組織中miR-146a、TLR4mRNA表達(dá)量Fig 2 Expression levels of miR-146a and TLR4 mRNA in myocardial tissue of rats in the 4 groups

2.3 比色法檢測(cè)大鼠血清心肌酶譜活性

模型組與假手術(shù)組相比大鼠血清cTnT、CK-MB、LDH 活性增加(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組上述指標(biāo)均活性降低(P<0.05)(表2)。

表2 4組大鼠血清心肌酶譜活性比較Table 2 Comparison of myocardial enzyme activity in serum of 4

2.4 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組心肌細(xì)胞分布較為整齊有規(guī)律、胞間距較小。模型組、miR-146a NC組心肌肌纖維斷裂腫脹、間質(zhì)充血明顯、結(jié)構(gòu)消失、細(xì)胞多處壞死界限不清，miR-146a agomir組與模型組、miR-146a NC組相比水腫減輕，上述病理均有一定改善(圖3)。

圖3 4組心肌組織形態(tài)學(xué)變化Fig 3 Morphological changes of myocardial tissue in 4 groups(×200)

2.5 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

模型組與假手術(shù)組相比心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加(均P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.05)(圖4)。

2.6 Western blot法檢測(cè)TLR4、TNF-α、NF-κB蛋白表達(dá)

模型組與假手術(shù)組相比大鼠心肌組織中TLR4、TNF-α、NF-κB蛋白明顯升高(均P<0.05)，miR-146a agomir組上述蛋白表達(dá)較miR-146a NC組、模型組明顯降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

MI/RI是復(fù)雜的多因素多途徑的綜合性病理生理過(guò)程，發(fā)生于犬類心臟冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型中[6]。本文建立心肌缺血/再灌注動(dòng)物模型后轉(zhuǎn)染miR-146a-a agomir能夠顯著改善心肌組織病理?yè)p傷，降低心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌酶譜水平，作用機(jī)制通過(guò)抑制相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

*P<0.05 compared with sham group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group圖4 4組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況Fig 4 Apoptosis of myocardial cells in 4 groups(×200,

*P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group圖5 4組大鼠心肌組織蛋白表達(dá)情況Fig 5 Expression of protein in myocardial tissue of rats in 4

miRNA是一種能夠通過(guò)DNA調(diào)控基因表達(dá)的保守型非編碼短鏈RNA序列，其可以誘發(fā)的mRNA降解在細(xì)胞增殖、分化等功能中意義重大[7]。miRNA的特異性表達(dá)在心力衰竭、心肌細(xì)胞凋亡等病理進(jìn)程中具有關(guān)鍵性作用[8]。miR-146a是具有免疫調(diào)控功能的mRNA。對(duì)24只I/R炎性腸損傷建模大鼠進(jìn)行試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-146a在大鼠肝組織中呈現(xiàn)低表達(dá)并介導(dǎo)TLR4活化刺激肝組織炎性損傷[9]。然而目前尚無(wú)關(guān)于miR-146a在MI/RI中作用的研究報(bào)道，本文研究結(jié)果顯示miR-146a過(guò)表達(dá)的miR-146a agomir組大鼠心肌細(xì)胞凋亡較模型組、miR-146a NC組明顯減少。HE染色觀察到miR-146a agomir組的細(xì)胞壞死、病灶范圍等情況較模型組、miR-146a NC組有所改善，以上結(jié)果均說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-146a在心肌細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮抑制作用。

cTnT、CK-MB主要分布在心肌組織中，其表達(dá)與患者損傷嚴(yán)重程度成正比。LDH存在于骨骼肌、心肌中，其表達(dá)的提高也間接提示了心肌受損[10]。48例心肌梗死患者血清檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)miR-302b表達(dá)上調(diào)與心肌細(xì)胞損傷相關(guān)，可誘導(dǎo)患者心肌細(xì)胞壞死或凋亡，同時(shí)研究還證實(shí)了miR-302b的表達(dá)上調(diào)與cTnT、CK-MB、LDH的表達(dá)呈正相關(guān)，提示cTnT、CK-MB、LDH高表達(dá)可加重心肌梗死患者心肌細(xì)胞損傷程度[11]。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)鹿茸多肽能夠通過(guò)抑制血清中心肌酶譜的表達(dá)改善MI/RI[12]。本文研究結(jié)果與之相似，推測(cè)miR-146a對(duì)大鼠MI/RI的保護(hù)作用與降低心肌酶譜水平相關(guān)。

TLR4源自TLRs家族，是一種存在于機(jī)體所有細(xì)胞系的炎性跨膜受體，能夠識(shí)別配體產(chǎn)生促炎以及炎性趨化因子引發(fā)機(jī)體炎性反應(yīng)，在感染性疾病研究中廣受關(guān)注[13]。TNF-α、NF-κB是TLR4的下游因子，TLR4激活后能夠刺激TNF-α產(chǎn)生炎性反應(yīng)，促使正常細(xì)胞凋亡，使心肌損傷嚴(yán)重化，而NF-κB能夠調(diào)控TLR4下游多種細(xì)胞因子的合成表達(dá)，其激活后可產(chǎn)生TNF-α形成惡性循環(huán)系統(tǒng)[14]。學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)給MI/RI大鼠注射吳茱萸次堿能夠減少M(fèi)I/RI大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量對(duì)大鼠心臟起到保護(hù)作用，并證實(shí)吳茱萸次堿對(duì)MI/RI大鼠的保護(hù)作用的發(fā)揮是通過(guò)截?cái)郥LR4信號(hào)通路阻止TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[15]。結(jié)果顯示TLR4拮抗劑干預(yù)的MI/RI小鼠心功能能得到改善，TLR4表達(dá)量顯著降低，血清促炎因子濃度降低而抗炎因子指標(biāo)上升。結(jié)果證實(shí)了TLR4表達(dá)下調(diào)后抑制炎性反應(yīng)對(duì)小鼠MI/RI起保護(hù)作用。因此推測(cè)miR-146a對(duì)大鼠MI/RI的保護(hù)作用與降低TLR4表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，miR-146a在MI/RI大鼠心肌細(xì)胞中低表達(dá)發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用，其上調(diào)后可通過(guò)降低心肌酶譜水平及TLR4表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而保護(hù)大鼠MI/RI。