達(dá)格列凈降低心力衰竭大鼠心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并緩解左室重構(gòu)

張志敏，茍麗沙，馬麗群，任 可，路 軍，魏 星，李慧杰，周圣華*

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院 1.心內(nèi)科；2.保健科，新疆 烏魯木齊 830000)

心力衰竭(heart failure)是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，持續(xù)高血糖、缺血缺氧、血壓升高等可單獨(dú)或協(xié)同誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、損傷、凋亡，引起心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭。除經(jīng)典改善心力衰竭、保護(hù)心肌細(xì)胞藥物外，近年研制的新型降糖藥物-達(dá)格列凈(鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑)可明顯改善糖尿病和非糖尿病心力衰竭患者的預(yù)后，具有顯著的獨(dú)立于降糖作用之外的心血管保護(hù)作用[1-2]。達(dá)格列凈是中國心力衰竭指南中明確指出的具有心血管保護(hù)作用的降糖藥[3]，但其獨(dú)立的心血管保護(hù)機(jī)制仍不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同分子機(jī)制之一，高糖、高血壓、高同型半胱氨酸血癥、缺血缺氧刺激等都可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[4-6]，而上述刺激因素持續(xù)存在可激活ERS相關(guān)促凋亡蛋白如CHOP、caspase12等，調(diào)控細(xì)胞凋亡發(fā)生。因此有效抑制ERS對細(xì)胞起保護(hù)作用，達(dá)格列凈是否有抑制心肌細(xì)胞ERS功效尚不可知。本研究通過主動(dòng)脈縮窄(transverse aortic contriction,TAC)術(shù)建立心力衰竭大鼠模型，使用不同劑量達(dá)格列凈干預(yù)治療，觀察其對心力衰竭大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響及探討其潛在心肌保護(hù)分子機(jī)制，為達(dá)格列凈臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物及試劑

SPF級6～8周齡成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g(新疆軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號：LJ-20206587)。達(dá)格列凈片(諾華制藥中國)；兔抗大鼠GRP78抗體及兔抗大鼠caspase12抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理:將大鼠分為對照組，腹主動(dòng)脈縮窄(TAC)模型組,達(dá)格列凈干預(yù)組(每日1次灌胃給予達(dá)格列凈0.5和1.0 mg/kg)，每組5只，實(shí)驗(yàn)共12周。

1.2.2 大鼠血壓值及心肌肥厚指數(shù)HWI及LVWI的測定:采用無創(chuàng)鼠尾血檢測系統(tǒng)檢測大鼠血壓值，將大鼠放入無創(chuàng)鼠尾血壓檢測系統(tǒng)筒形固定器中，將脈壓套置大鼠尾部近心端處，高敏脈搏換能器置于尾巴中上1/3處并固定，待脈搏穩(wěn)定后測量血壓。記錄其心率，平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)=[舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓)]。大鼠禁食不禁水24 h，稱取大鼠體質(zhì)量(body weight,BW)，使用戊巴比妥鈉充分麻醉大鼠后開胸剪取心臟，剪去主動(dòng)脈根部及脂肪組織，稱取全心質(zhì)量(heart weight,HW)。再剪去心房及右心室，保留室間隔及左心室，稱取左心室質(zhì)量(left ventricular weight,LVW)。計(jì)算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)比值。

1.2.3 大鼠心臟功能及心肌組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察:采用小動(dòng)物超聲檢測大鼠心臟功能，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠安靜后，使用13 MHz M型超聲探頭連續(xù)測量5個(gè)心動(dòng)周期。記錄左心室收縮末期容積、左心室舒張末期容積、左心室收縮末期內(nèi)徑、左心室舒張末期內(nèi)徑，以計(jì)算EF及ES。將新鮮大鼠心肌組織置于多聚甲醛中固定后，經(jīng)不同濃度乙醇梯度脫水，石蠟包埋，沿心臟縱軸連續(xù)切片，使用HE染色，置于光鏡下觀察心肌組織形態(tài)改變。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠心肌組織中GRP78及CHOP的表達(dá):將大鼠心肌組織的石蠟切片經(jīng)脫蠟→脫水→雙氧水封閉→抗原修復(fù)→非特異性抗原封閉等步驟后，分別滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠GRP78及caspase 12一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜。室溫復(fù)溫20 min后PBS洗滌，滴加1∶500稀釋羊抗兔IgG于室溫下孵育30 min，新鮮配置二甲基聯(lián)苯胺顯色，依次經(jīng)蘇木精復(fù)染→乙醇脫水→透明→中性樹膠封片。于光鏡下觀察染色效果，并拍照記錄。

1.2.5 Western blot檢測大鼠心肌組織中GRP78及CHOP表達(dá):取大鼠心肌組織，加適量組織裂解液，置于冰上研磨，靜置30 min后取上清液，于4 ℃10 000 r/min離心10 min，留上清液。取少量上清液測蛋白濃度，余上清液中按比例加入上樣緩沖液后于100 ℃沸水中煮5 min，置于-80 ℃低溫冰箱保存。配制10%分離膠，取等量蛋白樣品，使用凝膠恒壓電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%牛奶的TBST中，搖床搖動(dòng)室溫封閉60 min。依次滴加1∶1 000兔抗大鼠GRP78、caspase 12抗體，4 ℃冰箱振蕩孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，1∶5 000 HRP-羊抗兔IgG室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜3，每次8 min,用ECL發(fā)光試劑于BIO-RAD成像系統(tǒng)發(fā)光成像，條帶使用Image軟件進(jìn)行吸光度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓、心率及左室重構(gòu)指標(biāo)的變化

與對照組相比，模型組大鼠MAP、HWI及 LVWI明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，達(dá)格列凈2組MAP明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，模型組顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，達(dá)格列凈組HWI及 LVWI明顯降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血壓、心率及左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of blood pressure,heart rate and left ventricular hemodynamics in

2.2 各組大鼠心功能指標(biāo)的變化

與對照組相比，模型組大鼠左心功能指標(biāo)EF及FS值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，達(dá)格列凈1組EF及FS值明顯升高(P<0.05)，達(dá)格列凈2組EF及FS值顯著升高(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group圖1 超聲心動(dòng)圖檢測各組大鼠LVEF及LVFS的變化Fig 1 Changes of LVEF and LVFS of rats in each group detected by echocardiography(×400)

2.3 HE染色顯示各組大鼠心肌組織改變

模型組大鼠心肌纖維排除紊亂，細(xì)胞分支多，組織間較為疏松，部分肌纖維斷裂；達(dá)格列凈1組大鼠心肌纖維排列紊亂及組織疏松較模型組好轉(zhuǎn)，少量肌纖維斷裂，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；達(dá)格列凈2組大鼠心肌纖維排列整齊，組織較為致密，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，未見分支(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色圖片F(xiàn)ig 2 Masson staining picture of myocardial tissue of rats in each group(×400)

2.4 免疫組化檢測大鼠心肌組織GRP78、caspase 12蛋白表達(dá)變化

對照組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達(dá)呈弱陽性，可見少量棕黃色顆粒分布于胞質(zhì)；模型組大鼠心肌組織可見大量GRP78及caspase 12蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，可見大量棕黃色顆粒分布于胞質(zhì)；達(dá)格列凈1組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達(dá)呈陽性，可見較多棕黃色顆粒分布于胞質(zhì)；達(dá)格列凈2組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達(dá)呈弱陽性，可見少量棕黃色顆粒分布于胞質(zhì)(圖3)。

2.5 Western blot檢測大鼠心肌組織GRP78、caspase 12蛋白表達(dá)水平變化

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白水平表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，達(dá)格列凈1組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，達(dá)格列凈2組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)(圖4)。

3 討論

心力衰竭的發(fā)生導(dǎo)致患者逐漸喪失勞動(dòng)力，給家庭及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，但其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜尚不完全明確，因此發(fā)現(xiàn)及研制新型抗心力衰竭藥物以改善心臟結(jié)構(gòu)及功能顯得尤為重要。達(dá)格列凈為新型降糖藥物[7]，多項(xiàng)大型臨床研究顯示[8-9]，達(dá)格列凈可顯著降低主要心血管不良事件、因心血管原因死亡和心力衰竭住院風(fēng)險(xiǎn)，但其獨(dú)立的抗心力衰竭作用尚不明確。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group圖3 免疫組化檢測各組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12 表達(dá)水平Fig 3 Expression levels of GRP78 and caspase 12 in myocardium of rats in each group were detected

本研究采用TAC術(shù)建立心衰大鼠模型，以觀察達(dá)格列凈對不伴糖尿病心力衰竭大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響。研究結(jié)果顯示，術(shù)后12周，大鼠血壓、心率、HWI及LVWI較對照組顯著升高，EF及ES水平較對照組顯著降低，心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞分支多，組織間較為疏松，部分肌纖維斷裂。使用不同劑量達(dá)格列凈自TAC術(shù)即干預(yù)治療至第12周末，與模型組相比，達(dá)格列凈組大鼠血壓、心率未見明顯變化，HWI及LVWI明顯降低，EF、FS水平明顯升高，HE染色見心肌細(xì)胞排列紊亂、組織疏松情況等明顯改善，表明達(dá)格列凈可抑制后負(fù)荷增加所致心肌重構(gòu)，改善心臟結(jié)構(gòu)及功能，對心肌細(xì)胞有效保護(hù)，但其潛在作用分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。

心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程中多種分子機(jī)制激活已被證實(shí)[10-12]。心肌細(xì)胞ERS激活是貫穿心力衰竭病理生理發(fā)展過程的經(jīng)典分子機(jī)制之一。使用TAC術(shù)建立心力衰竭小鼠模型，模型組小鼠心肌組織ERS相關(guān)信號通路激活[13]，心肌細(xì)胞應(yīng)激啟動(dòng)蛋白GRP78表達(dá)顯著升高，促凋亡蛋白caspase12表達(dá)顯著升高，表明持續(xù)后負(fù)荷過度激活心肌細(xì)胞ERS，誘導(dǎo)促凋亡，這與既往研究結(jié)果一致[14]。使用達(dá)格列凈干預(yù)后，大鼠心肌細(xì)胞GRP78及caspase12蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，表明達(dá)格列凈降低心肌細(xì)胞ERS起始激活蛋白GRP78表達(dá)，從TAC術(shù)后早期即對ERS激活有抑制作用，從而減少促凋亡蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果均提示抑制ERS可能是達(dá)格列凈保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心肌結(jié)構(gòu)和功能，延緩心力衰竭進(jìn)展的分子機(jī)制之一。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group圖4 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP蛋白表達(dá)的變化Fig 4 Changes of GRP78 and CHOP protein expressions in myocardial tissue of rats in each group detected by Western n=6)

綜上所述，達(dá)格列凈可改善TAC術(shù)后心力衰竭大鼠左室重構(gòu)，改善心臟結(jié)構(gòu)及功能，達(dá)格列凈干預(yù)可抑制后負(fù)荷增加誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ERS激活，對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用，可能是其緩解左室重構(gòu)及改善心力衰竭的分子機(jī)制之一，本研究為達(dá)格列凈具有心血管保護(hù)作用提供了新的理論依據(jù)。