YAP、TAZ在人喉癌組織中的表達及其臨床意義

朱麗明 那學武 李海洲

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，好發(fā)于40歲以上男性，以聲門上型和聲門型多見，又以鱗癌為常見組織學類型[1]。目前喉癌的主要治療手段仍為手術切除，早期喉癌術后患者預后通常較好，5年生存率遠高于晚期患者[2]，且早期喉癌可行喉顯微激光手術切除，與傳統(tǒng)開放手術相比具有創(chuàng)傷小、恢復快、并發(fā)癥少等優(yōu)點，患者無病生存率顯著上升[3]。而晚期患者通常只能行開放手術或無法手術，患者生存質量明顯下降。若能在喉癌早期對其進行診斷和治療，可以大大提升患者生存質量。近年來研究發(fā)現(xiàn)Hippo通路在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。Hippo通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內，具有高度保守的特點，在調控細胞增殖、促進組織再生等生命活動中發(fā)揮作用[4]。YAP蛋白是Hippo通路的重要效應器，和其旁系同源TAZ蛋白共同構成Hippo通路的關鍵轉錄共刺激分子[5]。YAP、TAZ在腫瘤中過表達促進腫瘤生長、浸潤，被認為是多種腫瘤的促癌基因[6]。研究表明多種腫瘤疾病中存在Hippo通路失活及YAP、TAZ高表達[7]，但其在喉癌中作用尚不明確。本研究旨在探討喉癌中YAP、TAZ的表達水平及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2012年3月至2015年3月于我院耳鼻咽喉頭頸外科就診的77例喉癌患者手術切除的腫瘤組織和正常癌旁組織?；颊咧心行?6例、女性11例；年齡33歲～76歲，其中≥60歲43例，<60歲34例；聲門型57例，聲門上型20例；高分化13例，中分化38例，低分化26例；腫瘤直徑<2 cm者21例，≥2 cm者56例；有淋巴結轉移者24例，無淋巴結轉移者53例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)合會UICCTNM分期標準(2002)進行分期，Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期36例。所有腫瘤組織經病理科驗證均為鱗癌，患者均為首次發(fā)病，未接受化療、放療、靶向治療和生物免疫治療。本研究所有研究對象均簽署對研究的知情同意書并經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組化法檢測組織中蛋白表達

組織蠟塊脫蠟水化，修復抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后滴加H2O2浸泡15 min，PBS沖洗后滴加山羊血清封閉，滴加一抗(YAP、TAZ一抗均購自美國BD生物公司，1∶200稀釋)，置于濕盒內4 ℃孵育過夜。次日PBS沖洗3次，室溫下滴加二抗孵育1 h，PBS沖洗后DAB顯色后蘇木精復染，梯度酒精脫水中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.3 結果判定

采用雙盲法評估結果，細胞質和(或)細胞核染為黃色、棕色或褐色記為陽性，每張切片選擇5個高倍鏡下視野(×200)，實用半量免疫評分法評價結果。陽性細胞占比：≤10%，記0分；>10%～25%，記1分；>25%～50%，記2分；>50%～75%，記3分；>75%，記4分。染色強度：黃色記1分、棕色記2分、褐色記3分。陽性細胞占比和染色強度相加，0～3分記為低表達，>3分記為高表達。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS21.0軟件進行分析，比較蛋白表達差異采用χ2檢驗，蛋白表達與喉癌臨床病理因素的關系采用Fisher’s檢驗，相關性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier生存曲線對患者生存情況進行比較，統(tǒng)計結果以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 YAP、TAZ蛋白在喉組織中的表達情況

免疫組化結果顯示喉癌組織中YAP蛋白高表達率為85.7%，高于正常癌旁組織的23.4%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；TAZ蛋白高表達率為81.8%，高于正常癌旁組織的27.3%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表1。

表1 YAP、TAZ蛋白在不同組織的表達情況(例，%)

2.2 YAP、TAZ蛋白表達與喉癌臨床因素的關系

患者組織中YAP、TAZ蛋白表達水平與患者年齡、性別和腫瘤解剖位置無關(P>0.05)，與患者腫瘤分期、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑、分化程度相關(P<0.05)，見表2。

表2 YAP、TAZ蛋白表達與臨床因素的關系/例

2.3 喉癌組織中YAP、TAZ蛋白的相關性

YAP高表達的66例喉癌患者組織中，有41例同時存在TAZ高表達。Spearman相關分析顯示YAP表達與TAZ呈正相關(γ=0.244，P=0.025)。

2.4 YAP、TAZ蛋白與喉癌患者預后的關系

本研究中77例喉癌患者5年隨訪存活61例，死亡13例，失訪3例，5年存活率79.2%。本研究使用總生存時間作為患者的預后指標，所有死亡患者均死于喉癌及并發(fā)癥，無其他原因導致的患者死亡。66例YAP高表達喉癌患者中存活51例，死亡12例，失訪3例；11例YAP低表達喉癌患者中存活10例，死亡1例，無失訪。63例TAZ高表達喉癌患者中存活49例，死亡12例，失訪2例；14例TAZ低表達喉癌患者中存活12例，死亡1例，失訪1例。使用Kaplan-Meier法進行生存分析，結果顯示YAP、TAZ高表達患者5年生存率明顯低于低表達患者(P<0.05)，見圖1。

圖1 YAP、TAZ蛋白與喉癌患者預后的關系

3 討論

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，以鱗癌多發(fā)，占所有患者的95%以上。喉癌的發(fā)生與多種因素相關，吸煙、飲酒、遺傳因素和HPV感染均能導致喉癌的發(fā)生[8]。隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，腫瘤精準治療能夠大大提升早期喉癌患者的生存率[9]，但對晚期患者治療效果仍不明顯，且晚期喉癌易復發(fā)，常需要再行喉全切術，嚴重降低患者生活質量[10]，而目前還沒有監(jiān)測晚期喉癌患者預后的特異性指標。近年來腫瘤分子標志物的研究受到廣泛關注，若發(fā)現(xiàn)與喉癌發(fā)病及預后相關的分子指標，就能夠對喉癌進行早期診斷或有效監(jiān)測患者預后，有利于喉癌的診治。

Hippo通路自發(fā)現(xiàn)以來被證實存在于多種哺乳動物體內，有研究表明其在調節(jié)器官大小、免疫穩(wěn)態(tài)和組織修復等多種生命活動中發(fā)揮作用[11]。在腫瘤中Hippo通路常作為抑癌基因調控細胞生長，通過磷酸化途徑抑制組織生長速度，調節(jié)細胞生長周期[12]。Hippo通路調控生命活動十分依賴其核心效應器YAP/TAZ的轉錄活性，通常情況下Hippo通路相關激酶抑制了YAP/TAZ的活性，但這種抑制關系在多種腫瘤中被解除[13]。研究表明許多腫瘤疾病中均存在Hippo通路相關基因缺失或表達異常，導致YAP、TAZ的高表達[14]，而YAP/TAZ具有促進細胞增殖、抑制凋亡作用，并在調節(jié)腫瘤干細胞發(fā)育的過程中扮演重要角色[15]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，YAP/TAZ還通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境促進腫瘤的生長，結腸癌中YAP能夠誘導巨噬細胞像M2表型極化，抑制機體抗腫瘤免疫[16]，而在前列腺癌中YAP/TAZ能夠耗竭體內樹突狀細胞完成免疫逃逸[17]。還有研究表明在乳腺癌中YAP/TAZ能夠促進上皮細胞間充質轉化，增強腫瘤細胞侵襲能力[18]，而在肝癌、肺癌、結腸癌等惡性腫瘤中YAP/TAZ的高表達常被視作疾病預后不良的指標[19]。本研究發(fā)現(xiàn)喉癌患者腫瘤組織中YAP/TAZ表達水平顯著高于正常癌旁組織(P<0.001)，可能與喉癌的發(fā)病相關，結果與文獻報道一致[20]。腫瘤組織中YAP/TAZ表達與患者疾病預后相關(P<0.05)，可能作為監(jiān)測喉癌預后的相關指標發(fā)揮作用。

相關性研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中YAP表達與TAZ呈正相關(γ=0.244，P=0.025)，提示YAP/TAZ可能通過聯(lián)合途徑參與喉癌的發(fā)生發(fā)展。喉癌患者組織中YAP、TAZ蛋白表達水平與患者年齡、性別和腫瘤解剖位置無關(P>0.05)，與患者腫瘤分期、有無淋巴結轉移、腫瘤直徑、分化程度相關(P<0.05)，提示YAP、TAZ參與了喉癌的侵襲和轉移。

綜上所述，本研究通過檢測喉癌患者組織及癌旁正常組織中YAP、TAZ的表達情況，發(fā)現(xiàn)YAP、TAZ與喉癌的發(fā)生發(fā)展及預后相關，提示YAP、TAZ的表達能夠在監(jiān)測患者預后中發(fā)揮作用。YAP和TAZ在喉癌組織中表達強度具有相關性，但二者在喉癌中的作用機制仍需進一步研究。