欖香烯乳聯(lián)合化療對(duì)Lewis肺癌的影響及機(jī)制

范瑞娟 王 瑾 郭醒爽 楊 敏

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出加速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，臨床預(yù)后較差，5年總生存率低于15%[1]。肺癌的臨床治療仍以化療為基礎(chǔ)，但化療藥物的副作用限制了其臨床應(yīng)用。中西醫(yī)結(jié)合可以達(dá)到降低毒性，提高效率的目的[2]。近年來(lái)，臨床腫瘤的治療越來(lái)越受到關(guān)注，特別是在改善癥狀，提高生活質(zhì)量方面。欖香烯是從姜科溫莪術(shù)揮發(fā)油中提取的抗癌活性成分，主要活性成分是β-欖香烯，其在臨床使用中乳化以獲得欖香烯乳劑注射劑[3]。欖香烯的抗癌生物活性主要是抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并且具有較輕微的不良反應(yīng)[4]。本次研究選取近交系C57BL/6小鼠40只，探討欖香烯乳聯(lián)合化療對(duì)Lewis肺癌的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取近交系C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，人工光照明暗各12 h，溫度20 ℃～24 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和攝食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Lewis肺癌小鼠模型建立 將Lewis肺癌細(xì)胞復(fù)蘇，并向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入100 ml/L胎牛血清用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)傳代。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在無(wú)菌條件下將Lewis肺癌細(xì)胞懸浮液(2×106/ml)接種到2只C57BL小鼠的右腋皮下。接種14天后，通過(guò)脫臼處死2只C57BL荷瘤的小鼠，在無(wú)菌條件下取出腫瘤組織，根據(jù)腫瘤質(zhì)量(g)與生理鹽水(ml)1∶3的比例制備腫瘤組織勻漿。將腫瘤組織勻漿(0.2 ml/只)接種另外38只C57BL小鼠，體重16～20 g，建立Lewis肺癌小鼠模型。

1.2.2 分組及給藥 隨機(jī)分為模型組、欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組，其中欖香烯乳組腹腔注射100 mg/kg/d欖香烯乳，化療組腹腔注射3 mg/kg/d足葉乙甙和3 mg/kg/d順鉑，聯(lián)合組腹腔注射100 mg/kg/d欖香烯乳、3 mg/kg/d足葉乙甙和3 mg/kg/d順鉑，連續(xù)7 d。

1.2.3 瘤體、脾臟及胸腺測(cè)量 取出小鼠脾臟和胸腺并稱重，并計(jì)算器官指數(shù)。用游標(biāo)卡尺(精確到0.1 mm)每天在同一時(shí)間測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑(a)和最短直徑(b)，并計(jì)算腫瘤體積(V)：V=ab2/2。

1.2.4 肺轉(zhuǎn)移灶檢測(cè) 各組小鼠肺組織用100 g/l多聚甲醛固定，解剖顯微鏡檢查肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。抑制率為(肺癌模型組中轉(zhuǎn)移的平均數(shù)-實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)移的平均數(shù))×100%/肺癌模型組平均轉(zhuǎn)移次數(shù)。

1.2.5 血清VEGF檢測(cè) 通過(guò)人VEGF ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中VEGF的濃度。根據(jù)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，并通過(guò)酶標(biāo)儀選擇492 nm的波長(zhǎng)測(cè)定。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 研磨腫瘤組織，并用組織蛋白提取試劑常規(guī)提取蛋白質(zhì)。從每組中取出4 μl蛋白質(zhì)樣品，并通過(guò)BCA方法定量蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品與等體積的2×SDS緩沖液混合，加熱變性，通過(guò)SDS-PAGE電泳分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜洗滌并在5%牛血清白蛋白溶液中在室溫下封閉1 h。洗滌后，將膜置于一抗稀釋液(兔抗小鼠Per2或SIRT1一抗溶液1∶100)中，并在4 ℃溫育過(guò)夜。第2天早上洗膜后，將其轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液(堿性磷酸鹽標(biāo)記的山羊抗兔IgG溶液1∶1000)，在室溫下孵育2 h，顯影。在出現(xiàn)明顯條帶后終止反應(yīng)，最后使用GIS-2020數(shù)字圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白質(zhì)雜交條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠瘤重、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較

欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均較模型組降低(P<0.05)，其中聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯低于欖香烯乳組、化療組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠瘤重、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較

2.2 各組小鼠免疫器官臟器指數(shù)比較

聯(lián)合組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于化療組和模型組(P<0.05)，但低于欖香烯乳組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠免疫器官臟器指數(shù)比較

2.3 各組小鼠血清VEGF水平比較

模型組、欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組血清VEGF分別為(112.24±15.54)pg/ml、(96.46±17.80)pg/ml、(84.03±16.61)pg/ml、(66.72±19.12)pg/ml，欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組血清VEGF均較模型組降低(P<0.05)，其中聯(lián)合組血清VEGF明顯低于欖香烯乳組、化療組(P<0.05)。

2.4 各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達(dá)比較

聯(lián)合組腫瘤組織Per2和SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于欖香烯乳組、化療組和模型組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達(dá)比較

A為模型組；B為欖香烯乳組；C為化療組；D為聯(lián)合組。

3 討論

肺癌是臨床預(yù)后不良的惡性腫瘤之一，化療在治療中占主導(dǎo)地位，但化療藥物會(huì)引起較強(qiáng)的不良反應(yīng)，其臨床應(yīng)用因此受限[1]。因此，尋找具有良好抗癌作用和小副作用的藥物是癌癥研究領(lǐng)域的重要方向。中醫(yī)藥在肺癌防治中的作用逐漸受到重視，在緩解癥狀，延長(zhǎng)生存期，提高治療依從性，減輕和增加療效，抵抗轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[4]。足葉乙甙是細(xì)胞周期特異性的抗腫瘤藥物，作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ靶點(diǎn)，形成穩(wěn)定的可逆復(fù)合物，可阻斷DNA修復(fù)過(guò)程，是主要的癌癥化療藥物；順鉑主要作用位點(diǎn)是DNA的嘌呤和嘧啶堿基，使癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過(guò)程受到抑制，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有抗癌譜廣，作用強(qiáng)的特點(diǎn)，可以和與各種抗腫瘤藥物協(xié)同作用，無(wú)交叉耐藥的特點(diǎn)[5]。

由足葉乙甙和順鉑組成的EP方案是用于治療小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，可以有效并廣泛用于臨床實(shí)踐。然而，臨床資料顯示，足葉乙甙有更嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如嚴(yán)重的骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)和肝腎損害等；順鉑的腎毒性和胃腸道反應(yīng)也很嚴(yán)重[6]。欖香烯具有副作用小，耐受性好，可提高治療依從性，并可與化療藥物聯(lián)合使用，達(dá)到降低毒性和提高療效的效果[7]。本次研究中，各組小鼠瘤重、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行比較，欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均較模型組降低，其中聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯低于欖香烯乳組、化療組。說(shuō)明欖香烯乳聯(lián)合足葉乙甙與順鉑化療方案可以顯著抑制肺癌小鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)過(guò)程，抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。各組小鼠免疫器官臟器指數(shù)比較，聯(lián)合組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于化療組和模型組，但低于欖香烯乳組，這表明單獨(dú)化療可導(dǎo)致肺癌小鼠脾臟和胸腺萎縮，聯(lián)合使用藥物可顯著提高肺癌小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，說(shuō)明欖香烯乳可以在進(jìn)入人體后保護(hù)人體的免疫器官，增強(qiáng)機(jī)體的自身免疫功能，從而發(fā)揮其降低毒性和提高效率的抗腫瘤作用。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的生物學(xué)功能主要是刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、促進(jìn)血管生成和增加微小血管的通透性，可以為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管網(wǎng)絡(luò)的建立提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8]。VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤微血管密度，惡性程度和轉(zhuǎn)移程度具有高度的正相關(guān)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]。VEGF與其受體結(jié)合后，促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管的形成和生長(zhǎng)，加速基底膜的降解，增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)肺癌的發(fā)展[10]。本次研究中，欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組血清VEGF均較模型組降低，其中聯(lián)合組血清VEGF明顯低于欖香烯乳組、化療組，表明欖香烯乳劑可抑制肺癌VEGF的分泌，降低血液中的濃度，減弱其對(duì)受體的影響，減緩腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，將欖香烯乳劑與化療聯(lián)合對(duì)VEGF的分泌抑制作用更強(qiáng)，表明兩者之間存在協(xié)同作用。

生物鐘是由身體自我產(chǎn)生的時(shí)間節(jié)律，不受外部因素的控制，與衰老、代謝紊亂和腫瘤形成密切相關(guān)[11]。生物體通過(guò)最近的節(jié)律調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，并且生物鐘基因的異常表達(dá)可能引起節(jié)律紊亂，導(dǎo)致腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)增加[12]。Per2基因是最近節(jié)律系統(tǒng)的重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和新陳代謝的多種信號(hào)通路。淋巴瘤和白血病組織中Per2蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常組織，誘導(dǎo)Per2高表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞周期停滯，增殖能力下降和細(xì)胞凋亡加速。這些結(jié)果表明Per2基因可以抑制腫瘤生長(zhǎng)；哺乳動(dòng)物SIRT1基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白3脫乙酰酶，其與酵母染色質(zhì)沉默因子2最同源，并具有調(diào)節(jié)生物代謝的功能[13]。SIRT1可通過(guò)去乙?；cPer2相互作用，在激活SIRT1后，Per2可以發(fā)生去乙?；⑶乙阴；腜er2可以通過(guò)磷酸化降解[14]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在腫瘤形成過(guò)程中具有致癌和抑癌基因功能，其關(guān)鍵作用是維持致癌基因和抑癌基因之間的平衡[15]。

本次研究中，各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達(dá)比較，聯(lián)合組腫瘤組織Per2和SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于欖香烯乳組、化療組和模型組。推測(cè)欖香烯乳抑制 Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能與生物鐘基因 Per2和SIRT1的表達(dá)被激活有關(guān)，且欖香烯乳聯(lián)合化療更能促進(jìn)腫瘤組織中 Per2 和 SIRT1 蛋白的表達(dá)，在臨床上治療肺癌的效果可能會(huì)更好。

綜上所述，欖香烯乳聯(lián)合化療對(duì)Lewis肺癌有較好的抑瘤作用，可能與免疫調(diào)節(jié)、VEGF下調(diào)，促進(jìn)Per2/SIRT1蛋白表達(dá)有關(guān)。