響應曲面法優(yōu)化微波樣品制備儀提取白及多糖工藝

楊曉麗，劉 里，丁夢娜，王秀連

(曲靖師范學院 化學與環(huán)境科學學院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

白及[1]味苦、甘澀、性微寒，是應用歷史悠久的藥食同源類中藥.白及具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌等功效，可治療肺傷咳血、外傷、胃及消化道潰瘍出血、燙火灼傷、皮膚皸裂等病癥[2-3].白及也是一種良好的天然生物工程材料，無毒副作用、安全舒適、可降解、無污染.另外，白及還有減少刺激、保護皮膚、美白、延緩衰老等功效[4].白及主要功能性成分是多糖[5]，其他主要化學成分還包括聯(lián)芐、菲衍生物，還含有少量的揮發(fā)油和粘液質[1].

已有文獻考察了加水量、浸泡時間、水浴溫度、提取時間、提取次數(shù)、醇沉濃度對白及多糖提取的影響[6-7].為了縮短提取時間，提升提取品質和效率，也嘗試將超聲[8-11]、酶解[12]、堿提[13]、微波協(xié)同技術[14]用于提取白及多糖.常用單因素[2]、正交試驗設計[8]、響應曲面法[6]探究白及多糖的最佳提取方案.單因素法對每個實驗參數(shù)孤立分析，簡單直接，但無法獲得參數(shù)間相互影響信息；正交試驗設計對實驗參數(shù)逐個水平進行分析，探討參數(shù)對試驗結果的影響；響應曲面法在優(yōu)化實驗參數(shù)的過程中可以連續(xù)分析并給出直觀圖形，克服了單因素和正交試驗的孤立性[15].

微波提取技術具有提取效率高、節(jié)省時間、節(jié)省溶劑、節(jié)能、污染小等優(yōu)點[16].近年微波提取技術逐漸用于多種藥物、食品中多糖的提取[17-23].直接用微波提取白及多糖的報道較少.本文探討了微波樣品制備儀在提取白及多糖中的應用，并采用響應曲面法優(yōu)化微波提取工藝.

1 材料與方法

1.1 材料

白及塊莖來自于曲靖某農業(yè)公司，將新鮮塊莖用清水洗凈，切片，60℃鼓風干燥箱烘干，中藥粉碎機粉碎，制樣機制樣，過80目篩.使用前60℃鼓風干燥箱烘干至恒重，置于干燥器中備用.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Multi-wave PRO 微波樣品制備儀：安東帕；紫外可見分光光度計：瓦里安 cary50；電子天平：奧豪斯AR224CN；超聲波清洗器：昆山超聲KQ3200B；電熱鼓風干燥箱：恒科DHG-9245A；高速中藥粉碎機：百信 LG-100；數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華 HH-4；離心機：凱達 TD5A；制樣粉碎機：開元 5E-PCIX100.

1.2.2 試劑

苯酚(重蒸)，濃硫酸，葡萄糖標準品，無水乙醇.

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

精確稱取混勻的白及塊莖粉末0.2000g，加入一定的水做提取劑，震蕩混勻樣品；在設定的參數(shù)下采用微波樣品制備儀進行多糖的提??；4000r / min離心10min得多糖提取液.

1.3.2 標準曲線

按照國標SNT4260-2015中的方法繪制標準曲線.

1.3.3 多糖物質含量的測定

精確移取2mL提取液，加入1mL 5g/L 淀粉酶，在60℃恒溫水浴中水解1h，加入12mL無水乙醇，將多糖沉淀析出.4000r/min離心10min得多糖.用水溶解多糖并定容至50mL得待測液.取0.5mL待測液用國標SNT4260-2015中硫酸苯酚法進行顯色反應，并以淀粉酶為空白在490nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線得待測液濃度并計算多糖提取率.

1.3.4 微波樣品制備儀參數(shù)設定

結合儀器溫度波動范圍、儀器的壓力等要求，multi-wave PRO 微波樣品制備儀參數(shù)設置如表1.

表1 微波樣品制備儀的參數(shù)設定

2 結果與討論

所有實驗均平行測定三次，結果為平均值.

2.1 葡萄糖標準曲線與換算因子

實驗測得標準曲線見圖1.

圖1 葡萄糖標準曲線

吸光度標準曲線為：A=0.079289c-0.004988(相關系數(shù)r=0.9983)，A—吸光度、c—濃度(單位mg/L).回歸分析結果表明，在2.8～14mg/L范圍內葡萄糖的質量濃度和吸光度呈現(xiàn)良好線性關系.按照國標SNT4260-2015中的方法取多糖換算因子f=0.9.

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 液料比對白及塊莖多糖提取的影響

固定功率100W、時間7min，液料比75～175mL/g，考察液料比對白及塊莖多糖提取效果影響，結果見圖2.

圖2 液料比對白及塊莖多糖提取影響

從圖2可見，隨著液料比增大，多糖提取率先提高后降低，整體波動在24.5%～26%范圍內，波動幅度不大.推測液料比對白及塊莖多糖提取影響較小.當液料比為75mL/g時，雖然由于多糖類物質的粘性可以使白及很好地分散和懸浮，但是當溫度升高時，白及粉末易黏附在容器壁上，使得提取不完全.當液料比大于125mL/g后，提取液較稀，不易發(fā)生黏附容器的現(xiàn)象，但溶液的粘度降低，使白及粉末的分散性不好，易沉于底部，使多糖溶出受限.當液料比為100mL/g時，白及塊莖多糖提取率最高.

2.2.2 微波功率比對白及塊莖多糖提取的影響

固定微波時間7min、液料比100mL/g，微波功率50～150W，考察微波功率對白及塊莖多糖提取效果影響，結果見圖3.

從圖3可見，隨著微波功率從75W增大到100W，白及塊莖多糖提取率快速提高而后降低.微波功率改變使得多糖提取率在21.5%～26%之間波動，波動范圍較大.推測微波功率對多糖提取率影響較大.當微波功率為50W時，7min后提取液升溫至64℃，微波功率和提取液溫度均低，多糖溶出慢，提取率低.當微波功率為75W時，7min后提取液升溫至83℃，多糖快速溶出.而當微波功率大于100W時，微波對多糖結構的破壞作用突出，使得多糖提取率降低.當微波功率為100W時，白及塊莖多糖提取率最高.

圖3 微波功率對白及塊莖多糖提取影響

2.2.3 微波時間比對白及塊莖多糖提取的影響

固定微波功率100W、液料比100mL/g，考察微波功率對白及塊莖多糖提取效果影響，結果見圖4.

圖4 微波時間對白及塊莖多糖提取影響

微波時間5min內，多糖提取率提升并不明顯.考察提取液溫度，3min后提取液溫度升高至58℃，5min后提取液溫度升高至83℃，之后微波時間的延長提取液都恒定在85℃.結合多糖提取率變化，發(fā)現(xiàn)溫度提升范圍內，多糖溶出增多但不快速.提取液溫度穩(wěn)定在85℃后，多糖開始快速溶出.當微波時間達到15min后，雖然提取液達到設定溫度使得微波功率衰減，但微波對多糖的破壞作用開始突顯，使得多糖提取率降低.

2.3 響應曲面法試驗設計和統(tǒng)計分析

選擇微波功率、微波時間、提取液料比(mL/g)三個實驗參數(shù).采用Box-Behnken模型設計響應曲面試驗方案，表2中給出了各實驗參數(shù)的高、中、低水平.

表2 微波樣品制備儀提取白及塊莖多糖實驗參數(shù)水平及編碼

采用MATLAB對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸分析.

2.4 模型的擬合

根據(jù)中心組合設計及結果(表3)，得到相應的二次擬合方程：

提取率Y/%=22.6689+0.7312A-0.01716B-0.01765C-0.01079A2+0.001391AB-0.004301AC-0.0002982B2+0.0005832BC-0.0000438C2

擬合模型方差分析結果見表4.從擬合模型方差分析結果可見，試驗選用的模型極顯著(p=0.0001)，失擬不顯著p=0.3816，說明擬合模型恰當.模型的相關系數(shù)R2=0.9924.根據(jù)擬合模型失擬性分析可知所建立的三元二次回歸方程擬合度較好，可以用于提取條件的估算.

表3 中心組合設計及結果

表4 中心組合設計二次擬合模型方差分析

擬合模型中各回歸系數(shù)的顯著性檢驗結果列于表5.

表5 二次擬合模型系數(shù)顯著性檢驗

擬合模型系數(shù)顯著性檢驗結果表明，各項因素均達到顯著水平，說明實驗參數(shù)均可以顯著影響提取率.

2.5 實驗參數(shù)的交叉影響

多元二次擬合方程所得的響應曲面圖及對應等高線圖，見圖5～7.據(jù)此分析兩因素的交互影響.

根據(jù)圖5a可見，在7～11min范圍內，隨著微波時間的延長多糖提取率快速提高，隨后提升緩慢.當微波時間和液料比確定的時候，微波功率提高使得多糖提取率略提高.從等高線圖可見，微波功率較高使多糖提取率先提高后降低，可以在較短的時間范圍內使多糖提取率提高，這是因為較強微波功率可以使得提取液溫度快速升高到85℃，實現(xiàn)多糖快速溶出.當提取液溫度升高到85℃后，微波功率會出現(xiàn)衰減，多糖溶出變慢.當微波時間過長的時候，微波對多糖結構的破壞作用將突顯，使得溶出的多糖量反而減少.微波功率低于75W時，多糖溶出較慢且容易因為微波時間較長使得破壞作用突出.微波功率高于120W，也容易破壞多糖結構.

圖5 微波時間與微波功率交互影響的響應曲面圖(a)和等高線圖(b)

由圖6a知，微波功率恒定時，液料比提高使得多糖提取率略有降低；隨著微波時間的延長，多糖提取率得到提升.觀察提取液，推測較小的液料比使得提取液粘稠，白及均勻分散，有利于多糖溶出.微波前期使得多糖快速溶出，之后再對提取液進行微波提取，使得提取出來的多糖結構被破壞.當微波功率較小時，微波時間的延長對多糖的溶出有明顯促進作用.由圖6b可見，較小的液料比有利于多糖提取.而液料比較大時，白及易沉淀在底部，不利于多糖溶出，即使延長微波時間也不能使多糖充分溶出.

圖6 微波時間與液料比交互影響的響應曲面圖(a)和等高線圖(b)

圖7a表明，微波時間恒定為10min時，液料比的減小和微波功率的增加都會使多糖提取率出現(xiàn)小幅度提高，等高線也說明了這一點.等高線圖還表明較小的液料比結合較低的微波功率有利于多糖的溶出.

圖7 微波功率與液料比交互影響的響應曲面圖(a)和等高線圖(b)

對比圖5～7可見，微波時間的改變使得響應曲面變化幅度最大，說明微波時間長短對多糖提取影響最顯著；微波功率影響居中；液料比的影響最小.較低的液料比、適當增加的微波功率和微波時間有利于白及多糖提取率的提高.

根據(jù)擬合曲線的優(yōu)化結果，確定最優(yōu)提取參數(shù)為微波時間15min、液料比75mL/g、微波功率100W，理論計算提取率為27.06%.用此參數(shù)進行5次平行驗證性實驗，實驗提取率為(27.10±0.10)%，與預測值吻合.文獻表明白及中多糖回流提取需要2.5～3小時[6]，酶解提取需要82min[12]，超聲提取需要50min[9]，而本文采用微波提取僅需要15min.這也說明了微波技術可以更快速提取白及多糖.

為了考察微波快速提取白及塊莖多糖的效率，應用最優(yōu)提取參數(shù)進行三次提取，混合三次提取液，測定三次提取多糖總含量.平行測定三次，多糖提取率結果為：(28.43±0.22)%.一次即可提取出約95%的多糖.和文獻報道的需要2～3次的提取[7]相比，微波提取一次即可提取完全，提取效率高.

3 結 論

用微波樣品制備儀對白及塊莖中的多糖進行快速提取.通過響應曲面得出微波時間、微波功率、液料比3個因素對多糖提取的影響主次順序為：微波時間﹥微波功率﹥液料比.確定微波提取的最佳工藝為：微波時間15min、微波功率100W、液料比75mL/g.在此條件下多糖提取率達(27.10±0.10)%.一次可提取出約95%的多糖.結果表明微波樣品制備儀用于白及塊莖多糖提取方便快捷、提取時間短、效率高，是一種理想的提取方法.