莖用萵苣褪綠心腐病調(diào)查研究

胡啟鑌，劉建密*，陳文樂，陳彩霞，黃培枝，林積秀

（1.福建三明市植保植檢站，福建三明 365000；2.福建永安市植保植檢站，福建永安 366000）

莖用萵苣是福建省春、秋兩季的主要經(jīng)濟(jì)作物，‘飛橋萵苣’作為主栽品種，具有地方特色，并獲“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”稱號(hào)。因其質(zhì)地爽脆，味道鮮甜、風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者歡迎，以‘飛橋萵苣’為主要品種的莖用萵苣種植已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)之一。

2005 年在‘飛橋萵苣’原產(chǎn)區(qū)永安等地首次出現(xiàn)一種萵苣新病害，帶病移栽后造成萵苣死苗、缺株，后期感染造成頂部葉片褪綠、生長(zhǎng)停滯、莖部變褐、不堪食用等；罹病株喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2008 年，該病在莖用萵苣種植區(qū)爆發(fā)為害，平均株發(fā)病率達(dá)20.5%，嚴(yán)重的地塊株發(fā)病率高達(dá)53.6%。2012 年明確了該病是一種植原體病害，并將之命名為“莖用萵苣褪綠心腐病”（lettuse chlorotic leaf rot disease，LCLRD）。該病的發(fā)生嚴(yán)重影響了莖用萵苣的產(chǎn)量、質(zhì)量和效益。因此，在‘飛橋萵苣’主栽區(qū)永安市調(diào)查了該病害的病原、傳播介體、寄主種類、病害發(fā)病規(guī)律及防控技術(shù)等，總結(jié)了一套科學(xué)有效的莖用萵苣褪綠心腐病綜合防控技術(shù)，以推廣應(yīng)用。

1 試驗(yàn)方法

1.1 病原鑒定方法

1.1.1 病因排查

為明確病因，在萵苣生產(chǎn)季開展了大量田間病因篩查試驗(yàn)。田間試驗(yàn)均設(shè)空白對(duì)照，按照正常生產(chǎn)栽培。缺素試驗(yàn)中各處理撒施或噴施不同元素（鈣肥、硼肥、錳肥、鋅肥等）種類的肥料；藥劑試驗(yàn)中不同處理噴施不同類型藥劑（治療細(xì)菌、抑制真菌、抗病毒劑、殺蟲劑、殺螨劑等藥劑）或全程覆蓋防蟲網(wǎng)；抗生素試驗(yàn)各處理采用不同類型抗生素（青霉素、土霉素）灌根的方法；不同類型的試驗(yàn)均設(shè)3 次重復(fù)，隨機(jī)排列，依次分年度開展。

室內(nèi)試驗(yàn)采用常規(guī)病原菌分離培養(yǎng)方法，室內(nèi)或保濕培養(yǎng)或直接用培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。根據(jù)病毒病的傳播特點(diǎn)，開展傳統(tǒng)的摩擦接毒試驗(yàn)。

1.1.2 病原鑒定

采用DAPI 熒光顯微鏡檢測(cè)。取新鮮萵苣切100～200 μm 厚度的薄片，用戊二醛固定，DAPI（4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸）染色，最后用Leica DM6000B 落射熒光顯微鏡檢查韌皮部篩管內(nèi)植原體特異性熒光的有無和強(qiáng)弱，紫外線激發(fā)濾光片波長(zhǎng)為365 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)為420 nm。

用PCR 法擴(kuò)增。使用植原體16S rDNA 基因序列通用引物R16mF2（5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′）和R16mR2（5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′），對(duì)病株及健康株分別提取總DNA，以提取的植物總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

采用電子顯微鏡觀察。取染病根和葉脈組織進(jìn)行固定和超薄切片，通過透射電子顯微鏡觀察植物韌皮部篩管中的植原體細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其形狀呈球狀、橢圓形或不規(guī)則形且大小在60～1 100 nm 范圍的無細(xì)胞壁菌體。另在植物維管束組織中找到成熟的篩管，在篩管內(nèi)觀察到符合的菌體形態(tài)，則判斷為植原體的把握性就很大。

1.2 傳播介體鑒定方法

利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2，對(duì)昆蟲樣本總DNA進(jìn)行巢式PCR 鑒定，檢測(cè)各種葉蟬在自然條件下攜帶莖用萵苣褪綠心腐植原體的情況。

葉蟬回接試驗(yàn)，萵苣生產(chǎn)季采用田間捕捉葉蟬活蟲，全部放入含有盆栽萵苣褪綠心腐病株的養(yǎng)蟲籠中，飼菌3 d 后將葉蟬從中挑選歸類后分別放入盆栽健株的養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng)，每個(gè)養(yǎng)蟲籠放置2～3 株經(jīng)防蟲網(wǎng)育苗的萵苣健株，每個(gè)養(yǎng)蟲籠放置同種類的昆蟲1～5 頭，觀察健株是否發(fā)病，30 d 后利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2，對(duì)萵苣樣本總DNA 進(jìn)行巢式PCR 鑒定。

1.3 寄主植物鑒定方法

在永安當(dāng)?shù)夭煌竟?jié)采集萵苣田間雜草及萵苣田周圍有疑似叢枝、簇芽、小葉、黃化等癥狀的農(nóng)作物和林木，利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴(kuò)增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2，對(duì)各植物樣本總DNA 進(jìn)行巢式PCR 鑒定，檢測(cè)各種植物帶菌情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原

2.1.1 田間癥狀

苗期無癥狀或癥狀不明顯，帶病植株移栽后至蓮座期，先是在心葉顯癥，心葉出現(xiàn)褪綠或褪紅，葉色變淡變白，隨后頂部葉片挺直變細(xì)，嫩葉基部流膠，而后停止生長(zhǎng)，最后心腐死株。旺長(zhǎng)抽莖后，罹病植株頂部葉片褪綠或褪紅變白、生長(zhǎng)停滯。剖開莖部，早期感染部位變褐或干枯，近根莖部外層變褐；后期感染莖中髓失水成空心狀，近根莖部略有變褐[1-2]。

2.1.2 病因排查分析

多年病因篩查試驗(yàn)結(jié)果已由項(xiàng)目組林積秀等[1-2]發(fā)表，根據(jù)多年的試驗(yàn)結(jié)果，分析得出：首先排除了缺鈣、硼、錳等缺素原因；運(yùn)用傳統(tǒng)的摩擦接毒試驗(yàn)，健康植株未發(fā)病，田間藥劑試驗(yàn)用抗病毒病藥劑處理對(duì)該病害無緩解效果，初判非病毒引起；室內(nèi)試驗(yàn)未能分離出細(xì)菌、真菌，將病部高濕培養(yǎng)，肉眼和顯微鏡均未發(fā)現(xiàn)有噴菌現(xiàn)象或菌絲體，同時(shí)各類型藥劑試驗(yàn)表明，細(xì)菌性、真菌性藥劑處理也沒有使病害變輕，初判非細(xì)菌、真菌引起；田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在萵苣地上部和地下部均未見明顯的咀嚼式口器昆蟲留下的蟲口傷，田間病因篩查試驗(yàn)中覆蓋防蟲網(wǎng)和噴施殺蟲劑兩個(gè)處理可以緩解或減少病害的發(fā)生，苗期覆蓋防蟲網(wǎng)大田期噴施殺蟲劑的復(fù)合處理有明顯的防控效果，試驗(yàn)確認(rèn)了萵苣褪綠心腐病的發(fā)生為害與某種或某些種昆蟲蟲量的多少密切相關(guān)，防蟲治蟲可以有效地減輕該病的發(fā)生。同時(shí)選用土霉素和青霉素兩種抗生素對(duì)病株進(jìn)行灌根試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用土霉素灌根處理后，病株癥狀發(fā)展得到有效抑制，新發(fā)枝葉逐漸恢復(fù)正常，而青霉素處理則無效，病株持續(xù)發(fā)展，直至整株死亡，由于青霉素作用部位為細(xì)胞壁，而土霉素作用部位為細(xì)胞膜，結(jié)合防蟲治蟲可減緩病害發(fā)生，推測(cè)該病應(yīng)為刺吸式口器昆蟲傳播且由只有細(xì)胞膜而無細(xì)胞壁的植原體引起[3-5]。

2.1.3 病原鑒定

用DAPI 熒光顯微鏡檢測(cè)得出（圖1），在病株主莖和葉中肋橫切片的外生韌皮部區(qū)域和內(nèi)生韌皮部區(qū)域都存在亮藍(lán)色的植原體DNA 被染色后發(fā)出的強(qiáng)熒光斑；從主莖和葉中肋的縱切片中可以看到長(zhǎng)條狀、充滿植原體DNA 藍(lán)熒光的篩管細(xì)胞，或單一篩管存在植原體熒光，或多條篩管同時(shí)充滿熒光，而健康植株中未見植原體特異性熒光。

圖1 萵苣植原體DAPI 熒光顯微鏡觀察結(jié)果Fig.1 DAPI fluorescence microscopy observations of symptomed lettuce plant

經(jīng)PCR 檢測(cè)，從病株中檢測(cè)得到大約1.4 kb 的DNA片段，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLAST 分析，為翠菊黃化組（16Sr Ⅰ）成員，進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出該組歸屬于16SrⅠ-B 亞組植原體，同時(shí)又用電子顯微鏡觀察了莖用萵苣褪綠心腐病植原體的微觀形態(tài)。在感病萵苣的葉脈和根的組織篩管細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了圓形或不規(guī)則形狀的植原體存在，大小在200～800 nm 之間[6-7]。

2.2 傳播介體

試驗(yàn)共檢測(cè)了12 種葉蟬和1 種蝽象，共計(jì)116 個(gè)樣本，其中葉蟬7 號(hào)（未定屬種）、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬4 種葉蟬的14 個(gè)樣本中攜帶植原體。如圖2 電泳圖譜所示，黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬的4～6 泳道與3 泳道的正對(duì)照均在1 200 bp 左右的位置顯示明亮的目的條帶,初判斷葉蟬7號(hào)、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬這4 種葉蟬為萵苣褪綠心腐病的潛在傳播媒介。

圖2 部分葉蟬帶菌情況巢式PCR 電泳圖譜Fig.2 Nested PCR electrophoresis map of some leafhopper

飼菌回接試驗(yàn)于2013—2016 年持續(xù)了做了3 個(gè)萵苣生產(chǎn)年度，共做了75 批次14 種昆蟲（包括葉蟬7 號(hào)、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬等10 種葉蟬，白背飛虱、褐飛虱和2 種蝽象）的回接試驗(yàn)，結(jié)果顯示：有2 次回接黑額二叉葉蟬的健株在回接后表現(xiàn)褪綠心腐癥狀，并檢測(cè)到了萵苣褪綠心腐病植原體；在黑額二叉葉蟬回接的3 次未顯癥萵苣上也檢測(cè)到萵苣褪綠心腐病植原體，從而確定了黑額二叉葉蟬為萵苣褪綠心腐病的媒介昆蟲[7]。

2.3 寄主植物

試驗(yàn)共采集了21 科61 種植物共計(jì)518 株樣本，其中農(nóng)作物種類有16 種，分別是油麥菜、萵苣、辣椒、白蘿卜、生菜、包菜、茼蒿菜、馬鈴薯、玉米、花生、甘薯、煙草、茄子、薏仁、空心菜和西紅柿；林木種類有4 種，分別是苦楝、竹柏、梧桐和竹子；雜草種類有41 種。

經(jīng)巢式PCR 檢測(cè)（如圖3 所示），泳道1 萵苣病株為正對(duì)照，泳道2～11 為其他植物，顯示與正對(duì)照有相同大小的目的條帶，即在辣椒、苦楝、油麥菜、生菜等中檢測(cè)到植原體的存在。同時(shí)在永安開展調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃椒、紅椒、雞爪椒和長(zhǎng)椒上檢測(cè)出植原體，而朝天椒和牛角椒未檢測(cè)出植原體，從而明確了辣椒、苦楝、油麥菜、生菜為莖用萵苣褪綠心腐病的中間寄主植物[7-9]。

圖3 部分寄主植物的巢式PCR 電泳圖片F(xiàn)ig.3 The nested PCR electrophoresis map of some of the host plants

3 發(fā)病規(guī)律

莖用萵苣播種早，葉蟬密度高發(fā)病重；氣溫高，遇天氣干旱，利于葉蟬活動(dòng)繁殖和植原體增殖，發(fā)病重；管理粗放，雜草多，發(fā)病重；連作田發(fā)病重。黑額二叉葉蟬蟲量大的田塊辣椒叢枝病（植原體病害）發(fā)病重，前作田為辣椒的田塊莖用萵苣褪綠心腐病發(fā)病重。經(jīng)蟲情測(cè)報(bào)燈下觀察，黑額二叉葉蟬發(fā)生與秋萵苣生長(zhǎng)期高度吻合，9—10 月為燈下高峰期。該葉蟬體型小，雄蟲2.6～2.7 mm，雌蟲2.7～2.8 mm，田間多在葉背面或雜草中棲息，活動(dòng)方式多為跳躍飛行，活動(dòng)范圍較小；驚擾后易跳躍，不易近距離觀察，田間未見卵少見若蟲，成蟲對(duì)黃板有趨性。

該病的初侵染源主要是中間寄主辣椒、苦楝、油麥菜和生菜，在萵苣生長(zhǎng)季（9 月至翌年4 月）通過黑額二叉葉蟬刺吸傳病，或本身帶毒的黑額二叉葉蟬直接為害傳?。辉摬〉脑偾秩局饕揽棵浇槔ハx黑額二叉葉蟬在田間短距離傳播；病原物需要在活體萵苣或中間寄主體內(nèi)越冬，也可在越冬的黑額二叉葉蟬體內(nèi)存活，來年氣候條件適宜，繼續(xù)傳播為害；春萵苣生產(chǎn)季結(jié)束后，黑額二叉葉蟬在中間寄主、雜草或其他植物上繼續(xù)繁殖生存，轉(zhuǎn)主為害辣椒等中間寄主，9 月份繼續(xù)為害秋萵苣[10]。

4 綜合防控技術(shù)及成效

4.1 綜合防控技術(shù)

根據(jù)莖用萵苣褪綠心腐病是植原體病害這一特征，在生產(chǎn)上宜采用“農(nóng)業(yè)防治、治蟲防病”的防治策略[10-12]，即協(xié)調(diào)應(yīng)用農(nóng)業(yè)、物理、生物、化學(xué)防治措施，開展生態(tài)調(diào)控，阻斷或減少蟲媒與作物的接觸傳病，控制田間蟲媒種群數(shù)量，防范莖用萵苣褪綠心腐病爆發(fā)成災(zāi)。

4.1.1 農(nóng)業(yè)防治

（1）適時(shí)播種

在三明高海拔地區(qū)（海拔500 m 以上），莖用萵苣播種期宜安排在9 月初，中低海拔地區(qū)（海拔500 m 以下），莖用萵苣播種期宜安排在9 月20 日左右。其他市、縣可按相應(yīng)氣象狀況調(diào)整播種期，遠(yuǎn)離辣椒、苦楝樹、油麥菜和生菜等其他寄主生長(zhǎng)地育苗，減少侵染為害。

（2）施足基肥

種植田要重施基肥，掌握在移栽前3～5 d，每667 m2施腐熟有機(jī)肥2 500 kg、鈣鎂磷肥100 kg 和45%三元復(fù)合肥50 kg，然后翻耕整畦。

（3）田間生態(tài)調(diào)控措施

一般在播種后18 d 左右，萵苣苗4～5 葉時(shí)打孔移栽。移苗帶土，宜在陰天或傍晚移栽定植，定植后澆透定根水。移栽后至團(tuán)棵期土壤要保持濕潤(rùn)，采用早晚噴淋澆水，澆透水，使田間一直保持高濕狀態(tài)，創(chuàng)造有利于幼苗扎根成活、不利于葉蟬生長(zhǎng)的環(huán)境，控制葉蟬種群的突增。幼苗成活后，結(jié)合灌水每667 m2每次追施5 kg 尿素和5 kg 硫酸鉀，隔5～7 d 澆施一次，促其早生快發(fā)，縮短易受害感病期。肉質(zhì)莖形成期要求水分充足，缺水莖棒小，莖基部表皮易開裂，團(tuán)棵期后忌潑澆，以溝灌為主，保持畦面干爽。蓮座期葉面噴施0.3%硼砂液一次。萵苣現(xiàn)蕾前或心葉與外葉齊平時(shí)及時(shí)采收。

（4）及時(shí)拔除病株補(bǔ)植健株

拔苗移栽時(shí)，要剔除已表現(xiàn)出輕微癥狀的感病株，做到少帶病苗進(jìn)大田。同時(shí)在移栽時(shí)要多預(yù)留一些假植苗備用。大田期要經(jīng)常巡查，發(fā)現(xiàn)病株須及時(shí)拔除，并從假植苗中取健株補(bǔ)栽。拔除的病株不能隨意丟棄，必須集中堆漚。

4.1.2 物理防治

（1）防蟲網(wǎng)覆蓋培育壯苗

播種后用30 目防蟲網(wǎng)覆蓋，網(wǎng)上加蓋黑色遮陽網(wǎng)。覆蓋形式為將竹片彎成小拱插于大田畦溝，拱架上覆蓋防蟲網(wǎng)，網(wǎng)底邊用土塊壓實(shí)，成小拱棚。要避免苗長(zhǎng)高后葉片緊貼防蟲網(wǎng)給葉蟬攝食傳病有可乘之機(jī)。稀播育壯苗，每10 m2播5 g 種子。萵苣出苗后去掉遮陽網(wǎng)。萵苣苗期施水、肥可直接從防蟲網(wǎng)上方施入，不能掀網(wǎng)。

萵苣苗移栽前2～3 d 揭開防蟲網(wǎng)煉苗時(shí)，要隨即噴施吡蚜酮+高效氯氰菊酯等農(nóng)藥防范葉蟬為害，同時(shí)做到帶藥移栽。

（2）大田期黃板誘殺

萵苣移栽大田后，應(yīng)立即懸掛黃板。每667 m2均勻懸掛25 cm×30 cm 的黃板30 片左右，黃板下端高出萵苣植株10～15 cm 為宜，并隨植株的生長(zhǎng)及時(shí)調(diào)整黃板的懸掛高度。

4.1.3 化學(xué)防治

（1）苗期噴藥防治蟲媒

苗期未采用防蟲網(wǎng)覆蓋育苗的，在第二片真葉展開時(shí)，選用吡蚜酮或噻蟲嗪加上高效氯氰菊酯，按照包裝說明的用量?jī)端畤婌F，防止葉蟬及其它害蟲為害傳??；7 d后再噴一次；移栽前2～3 d 時(shí)再噴一次藥，帶入大田，防范剛移栽就遭受葉蟬的取食傳病。采用防蟲網(wǎng)覆蓋育苗的，需在移栽前2～3 d 揭網(wǎng)煉苗時(shí)噴一次上述藥劑，之后帶入大田。

（2）大田期適時(shí)噴藥防治葉蟬

萵苣移栽7 d 后選用吡蚜酮或噻蟲嗪與醚菊酯或高效氯氰菊酯或聯(lián)苯菊酯，按照包裝說明，兌水噴霧防治，藥后5～7 d 續(xù)噴1 次，藥劑輪換使用，防范大田前期媒介葉蟬取食傳病。

4.2 經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)成效

4.2.1 經(jīng)濟(jì)效益顯著

2014—2018 年5 年間，項(xiàng)目組在永安、大田、沙縣、建甌、武平等縣（市）建立莖用萵苣褪綠心腐病綜合防控技術(shù)示范片，示范面積為200 hm2。實(shí)驗(yàn)得出：該病平均株發(fā)病率1.64%、防治效果達(dá)90.5%，平均產(chǎn)量達(dá)3 513.8 kg/667 m2，比對(duì)照增產(chǎn)437.7 kg/667 m2，萵苣價(jià)格按1.5元/kg 計(jì)算，增收656.55 元/667 m2。經(jīng)多年萵苣農(nóng)戶實(shí)際調(diào)查結(jié)合試驗(yàn)示范，示范區(qū)節(jié)工0.7 d/667 m2，按日工資100 元計(jì)算，可節(jié)約工本70 元/667 m2；示范區(qū)減少物化成本15.7 元/667 m2；示范區(qū)減少農(nóng)本85.7 元/667 m2。增收節(jié)支742.25 元/667 m2，項(xiàng)目實(shí)施5 年累計(jì)推廣9.1萬hm2，總經(jīng)濟(jì)效益10 億元以上，經(jīng)濟(jì)效益顯著。

4.2.2 社會(huì)、生態(tài)效益顯著

明確了萵苣褪綠心腐病的發(fā)病原因，并采取了高效的綜合防控措施，有效抑制了萵苣產(chǎn)區(qū)莖用萵苣褪綠心腐病的爆發(fā)為害，增加了經(jīng)濟(jì)效益，因此萵苣種植戶、消費(fèi)者滿意度逐年上升，社會(huì)效益明顯，同時(shí)也減少了農(nóng)藥殘留，保護(hù)了田間生物的多樣性和農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，生態(tài)效益顯著。

5 展望

自植原體被發(fā)現(xiàn)以來，植原體病害研究取得了重要進(jìn)展。但由于植原體為韌皮部?；?，不易在培養(yǎng)基上進(jìn)行人工培養(yǎng)，因此對(duì)植原體的研究依然面臨著許多困難和挑戰(zhàn)，這也就限定了病害控制手段的開發(fā)。目前有效的措施包括加強(qiáng)防控、利用寄主植物抗性、清除初侵染源和綜合治理媒介昆蟲切斷傳播途徑等，可以控制植原體病害的發(fā)生和流行[11-12]，但針對(duì)植原體病原本身的防控研究較滯后。

就萵苣褪綠心腐病而言，其媒介昆蟲、中間寄主等還有待深入研究。如在萵苣、辣椒等田間發(fā)現(xiàn)了形態(tài)特征有明顯不同的30 余種葉蟬，這些種類中如何分類定名，有待進(jìn)一步研究，其中一種葉蟬優(yōu)勢(shì)種群可能為新種。在中間寄主的研究方面，本試驗(yàn)在分析萵苣褪綠心腐病時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些其他作物的植原體病害，如辣椒叢枝病，這種病害易與病毒病混淆；同時(shí)在植原體病害本底調(diào)查等方面還有待進(jìn)一步研究。