不同眼內(nèi)灌注液對(duì)視網(wǎng)膜組織學(xué)及功能的影響

朱莉 苗恒 胡欽瑞 劉志明 白玉婧 虞有智 傅亞飛 夏會(huì)卡 黃旅珍 齊赟 鄧洵 李巖 黎曉新

北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科 眼視光中心 眼病與視光醫(yī)學(xué)研究所 視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病診治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部眼視光學(xué)院 100044

表1 BSS和CEIIS組成成分比較Table 1 Comparison of components between BSS and CEIIS灌注液 相同成分不同成分BSS NaCl、KCl、CaCl2·2H2OMgCl2·6H2O、C2H3NaO2·3H2O、C6H5Na3O7·2H2OCEIIS NaCl、KCl、CaCl2·2H2OMgSO4、NaHCO3、C6H12O6·H2O 注:BSS:平衡鹽灌洗液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液 Note:BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

玻璃體切割術(shù)中改進(jìn)眼內(nèi)灌注液可以更好地保護(hù)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)并改善視網(wǎng)膜功能[1-3]，減少對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。眼組織的新陳代謝有賴于眼內(nèi)液體成分及其作用，如O2、pH和滲透壓等。將無菌平衡鹽灌洗液(balanced saline solution，BSS)與改良無菌BSS(必施佳)對(duì)眼組織的影響進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兔眼玻璃體切割術(shù)中應(yīng)用乳酸林格液對(duì)術(shù)后視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)的a波、b波振幅低于正常值所持續(xù)的時(shí)間比BSS和改良BSS更長(zhǎng)[4]，推測(cè)乳酸林格液的低pH、高乳酸水平和低滲透壓可能對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生永久性的損傷。還有研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體切割術(shù)后早期病變主要發(fā)生在視網(wǎng)膜內(nèi)，包括視網(wǎng)膜的各層缺損或脫離、視神經(jīng)纖維層外露、內(nèi)叢狀層水腫和層厚增加等[5-7]，因此術(shù)眼術(shù)后視力恢復(fù)可能與術(shù)中灌注液介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化有關(guān)。葡萄糖是眼內(nèi)灌注液中的重要組成成分，是維持視網(wǎng)膜正常功能的必要元素。復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液(compound electrolyte intraocular irrigating solution，CEIIS)中硫酸鎂、碳酸氫鈉和葡萄糖的成分與BSS稍有不同(表1)，更符合眼組織細(xì)胞代謝的生理需求，但目前鮮見BSS與CEIIS對(duì)眼組織細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)影響的比較。本研究擬觀察這2種眼內(nèi)灌注液對(duì)體外培養(yǎng)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(human corneal endothelial cells，HCEC)、人視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithelium，HRPE)細(xì)胞和大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)生存的影響，并比較2種眼內(nèi)灌注液對(duì)兔玻璃體切割術(shù)后視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)的影響，為臨床玻璃體切割手術(shù)中眼內(nèi)灌注液的選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物 HRPE細(xì)胞系(CRL2302)(美國(guó)ATTC細(xì)胞庫(kù))；HCEC系(ACC647)(德國(guó)微生物菌種保藏中心)；大鼠RGC(武漢普諾賽生命科技有限公司)。HRPE細(xì)胞系和HCEC系均由天津科美生物科技有限公司進(jìn)行STR分析；采用免疫熒光染色法測(cè)定神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志蛋白R(shí)bpms和Brn3a在RGC中的表達(dá)。3～4月齡新西蘭大耳白兔16只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)和使用遵循美國(guó)視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)制定的ARVO聲明。本研究方案經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(批文號(hào)：2019PHE059)。

1.1.2主要試劑及儀器 BSS(美國(guó)Alcon公司)；CEIIS(沈陽興齊制藥有限公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國(guó)Thermo公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(BCA法)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD Biosciences公司)；小鼠抗bax(89477)、小鼠抗bcl-2(15071)、小鼠抗caspase-3(9668)、小鼠抗caspase-9(9508)多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；Alexa-647-結(jié)合山羊抗兔二抗(ab150083)、Alexa-488-結(jié)合山羊抗小鼠二抗(ab150113)、Alexa-647-結(jié)合驢抗山羊二抗(ab150135)、兔抗細(xì)胞色素C抗體(ab90529)、兔抗閉鎖小帶蛋白(zonula occluden-1，ZO-1)抗體(ab221547)(英國(guó)Abcam公司)；TUNEL試劑盒(QIA33)(美國(guó)Sigma公司)。23G玻璃體切割系統(tǒng)(Constellation Vision System，美國(guó)Alcon公司)；全視野閃光ERG記錄系統(tǒng)(RETIport，德國(guó)羅蘭公司)；離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；流式細(xì)胞儀(FACSCanto Ⅱ，美國(guó)BD公司)；酶標(biāo)儀(Imark，美國(guó)Bio-Rad公司)；熒光倒置顯微鏡(IX53，日本Olympus公司)；眼科超顯微成像系統(tǒng)(4D-ISOCT，英國(guó)Optoprobe公司)；超薄切片機(jī)(LEICA EM UC6，德國(guó)Leica公司)；透射電子顯微鏡(Titan，美國(guó)FEI公司)；光相干斷層掃描儀(SPECTRALIS，德國(guó)海德堡公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組及培養(yǎng) 取HRPE細(xì)胞、HCEC和大鼠RGC，常規(guī)培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞達(dá)到70%以上融合時(shí)，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、BSS組和CEIIS組。正常對(duì)照組HRPE細(xì)胞和HCEC培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM/F12中，大鼠RGC培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)20% FBS的DMEM/F12中，BSS組和CEIIS組各細(xì)胞分別培養(yǎng)于BSS或CEIIS眼內(nèi)灌注液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 采用抽簽法將15只實(shí)驗(yàn)兔分為對(duì)照組3只、BSS組6只和CEIIS組6只，均取左眼為實(shí)驗(yàn)眼，根據(jù)分組在玻璃體切割術(shù)中分別采用BSS和CEIIS眼內(nèi)灌注液，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔不進(jìn)行手術(shù)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物玻璃體切割手術(shù) 采用肌內(nèi)注射氯胺酮(35 mg/kg)和甲苯噻嗪(5 mg/kg)混合物行實(shí)驗(yàn)兔全身麻醉，手術(shù)期間以同樣注射方法追加氯胺酮18 mg/kg和甲苯噻嗪5 mg/kg；術(shù)前雙眼用左氧氟沙星滴眼液各點(diǎn)眼3滴，托吡卡胺滴眼液點(diǎn)術(shù)眼擴(kuò)瞳；動(dòng)物麻醉后用慶大霉素注射液反復(fù)沖洗結(jié)膜囊，采用鹽酸丁卡因滴眼液點(diǎn)眼行表面麻醉。采用23G玻璃體切割系統(tǒng)行玻璃體切割術(shù)，操作如下：切開球結(jié)膜，做標(biāo)準(zhǔn)3個(gè)鞏膜切口，將填充頭、玻璃體切割頭和光纖經(jīng)角膜緣后1 mm處進(jìn)入玻璃體腔；術(shù)中選擇標(biāo)準(zhǔn)化溶液瓶高度以行玻璃體腔灌注，除保留靠近視網(wǎng)膜的玻璃體以外，對(duì)其他部分玻璃體進(jìn)行切割。術(shù)中沖洗液維持60 min，總手術(shù)時(shí)間不到1.5 h，用7-0縫合線縫合切口；術(shù)后用地塞米松滴眼液點(diǎn)眼。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)皆由同一人完成。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中并進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)24 h，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000×g離心5 min，收集沉淀；用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)洗滌3次，將細(xì)胞重懸于含annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)的結(jié)合緩沖液中，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。將細(xì)胞重懸于含有PI和RNase的結(jié)合緩沖液中，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板并進(jìn)行分組處理，于培養(yǎng)12、24和48 h向每孔添加10 μl CCK-8溶液，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔波長(zhǎng)450 nm處吸光度(A)值。

1.2.6免疫熒光法測(cè)定細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種在96孔板中，培養(yǎng)24 h后用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定15 min，用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h；分別置于小鼠抗bax抗體(1∶ 1 000)、兔抗細(xì)胞色素C抗體(1∶ 1 000)、小鼠抗bcl-2抗體(1∶ 1 000)、小鼠抗caspase-3抗體(1∶ 1 000)、小鼠抗caspase-9抗體(1∶ 1 000)和兔抗ZO-1抗體(1∶ 1 000)4 ℃下孵育過夜，PBS洗滌3次；用Alexa-647結(jié)合山羊抗兔二抗(1∶ 2 000)、Alexa-488結(jié)合山羊抗小鼠二抗(1∶ 2 000)和Alexa-647結(jié)合驢抗山羊二抗(1∶ 2 000)室溫下避光孵育1 h，PBS洗滌3次；置于DAPI中室溫下孵育5 min，PBS洗滌3次；熒光倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞和視網(wǎng)膜中相應(yīng)蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度。

1.2.7各組細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷測(cè)定 按照SDH和LDH檢測(cè)試劑盒說明書的步驟，提前將細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔1×106細(xì)胞，分別于12、24、48 h每孔加入預(yù)冷100 μl分析緩沖液，冰上裂解10 min，10 000×g離心5 min，取上清，向每孔加入50 μl裂解上清，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，再加入50 μl反應(yīng)混合物(分析緩沖液46 μl+基底混合物2 μl+探針2 μl)；將96孔板于25 ℃下孵育，每5 min測(cè)1次；用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔600 nm處A值，總孵育時(shí)間不超過30 min。陽性對(duì)照由試劑盒提供。

1.2.8TUNEL染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜各層細(xì)胞的早期凋亡情況 采用肌內(nèi)注射行全身麻醉，摘取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24 h各3只兔左眼球，浸入眼球固定液中，空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔；眼球固定10 min后，用1 ml注射器針頭于角膜正中央穿刺以利于固定液進(jìn)入眼球，繼續(xù)固定過夜；標(biāo)本經(jīng)過固定和沖洗后在脫水機(jī)中梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，行石蠟包埋；沿視神經(jīng)與眼軸平行的平面進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為5 μm，60 ℃烤片10 h，備用。按照TUNEL試劑盒說明書步驟，取切片用蛋白酶K于37 ℃條件下孵育30 min，PBS清洗3次，每次3 min；用體積分?jǐn)?shù)3% H2O2封閉液室溫封閉10 min，PBS清洗3次，每次3 min；滴加30 μl新鮮配置的TUNEL混合液，于37 ℃條件下孵育60 min，PBS清洗3次，每次3 min；滴加50 μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min，PBS清洗3次，每次3 min；滴加200 μl DAB顯色液，室溫孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min；用蘇木素染色液染核，清洗3次后封片直接觀察。取各組眼球各3張切片用于TUNEL染色，計(jì)算100倍顯微鏡視野下TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)3種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×200，標(biāo)尺=20 μm) 隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，BSS組和CEIIS組細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，正常對(duì)照組細(xì)胞數(shù)逐漸增多 HCEC：人角膜內(nèi)皮細(xì)胞；HRPE：人視網(wǎng)膜色素上皮；RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；BSS：平衡鹽灌洗液；CEIIS：復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液 Figure 1 The morphological findings of HCEC,HRPE and RGC cells under different culture conditions at various time points (×200,bar=20 μm) With the extension of culture time,the number of cells in the BSS group and CEIIS group was decreased gradually,and the number of cells in the normal control group was increased gradually HCEC：human corneal endothelial cells;HRPE:human retinal pigment epithelium;RGC:retinal ganglion cells；BSS:balanced salt solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

1.2.9免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定兔視網(wǎng)膜組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組眼球石蠟切片，脫蠟，抗原修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫；用3% H2O2封閉液室溫孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加小鼠抗bax抗體(1∶ 500)、兔抗細(xì)胞色素C抗體(1∶ 500)4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加增強(qiáng)酶聚合物，室溫孵育20 min；PBS沖洗3次，每次3 min；加入新鮮配制的DAB顯色液，室溫孵育5～8 min；自來水沖洗，蘇木素染色液孵育20 s，封片后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.10全視野閃光ERG檢查術(shù)眼視網(wǎng)膜功能 分別于術(shù)前和術(shù)后24 h，采用全視野閃光ERG記錄系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)兔左眼進(jìn)行閃光ERG檢查，檢查過程遵循國(guó)際臨床視覺電生理學(xué)會(huì)的記錄標(biāo)準(zhǔn)。在絕對(duì)暗室的紅光照明下(波長(zhǎng)>650 nm)進(jìn)行ERG記錄；采用托吡卡胺滴眼液點(diǎn)眼擴(kuò)瞳，采用鹽酸丁卡因滴眼液點(diǎn)眼表面麻醉；動(dòng)物在暗室中暗適應(yīng)1 h，記錄暗適應(yīng)ERG、振蕩電位(oscillatory potential，OPs)和明適應(yīng)ERG；檢查時(shí)將金屬環(huán)狀電極對(duì)準(zhǔn)角膜中央，參考針狀電極插入實(shí)驗(yàn)兔頰部皮膚下，盡可能遠(yuǎn)離心臟，地電極插入尾部皮下；按照設(shè)定程序參數(shù)開始進(jìn)行閃光ERG刺激，記錄a波、b波的振幅。

1.2.11OCT檢查術(shù)眼視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變化 分別于術(shù)前和術(shù)后24 h，采用光相干斷層掃描儀對(duì)全身麻醉狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)兔術(shù)眼視網(wǎng)膜視盤部位進(jìn)行檢測(cè)，觀察各組實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變化。

1.2.12透射電子顯微鏡下觀察術(shù)眼超微結(jié)構(gòu)變化 取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24 h實(shí)驗(yàn)兔各3只，采用肌內(nèi)注射全身麻醉，摘取左眼眼球，用體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定3 h，用0.1 mol/L PBS溶液(pH7.2)于4 ℃條件下洗滌2次，每次10 min；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸于4 ℃條件下固定1 h，直至樣品變黑；將固定過的眼球用0.1 mol/L PBS溶液4 ℃條件下洗滌2次，每次10 min；依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%乙醇4 ℃條件下各脫水10 min，然后用100%乙醇室溫下脫水3次，每次10 min；采用100%乙醇與環(huán)氧丙烷等比例混合溶液室溫下滲透10 min，環(huán)氧丙烷室溫下滲透10 min；Epon812與環(huán)氧丙烷等比例混合溶液浸透30 min，真空干燥儀(0.2～0.4 kg/cm2)室溫條件下干燥2 h以上；使用Epon812包埋，40 ℃條件下聚合2 h，60 ℃條件下聚合4 h，80 ℃條件下聚合10 h；沿視神經(jīng)與眼軸平行的平面進(jìn)行半薄切片，切片厚度為1 000 nm，甲苯胺藍(lán)染色1 min，確定視網(wǎng)膜的位置及結(jié)構(gòu)，再行超薄切片，切片厚度為70 nm；醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液室溫下染色10 min，漂洗后透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)接近正態(tài)分布，以mean±SD表示，經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。各組間測(cè)量指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

倒置顯微鏡下觀察可見，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，BSS組和CEIIS組細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，正常對(duì)照組細(xì)胞數(shù)逐漸增多。培養(yǎng)48 h，BSS組培養(yǎng)基中可見大量漂浮細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不均一；CEIIS組培養(yǎng)細(xì)胞排列致密整齊，細(xì)胞形態(tài)和大小均一。BSS組和CEIIS組細(xì)胞數(shù)量均少于正常對(duì)照組(圖1)。

圖2 各組3種細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期流式細(xì)胞分析圖 A：細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞分析圖 B：細(xì)胞周期流式細(xì)胞分析圖 BSS：平衡鹽灌洗液；CEIIS：復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液；HCEC：人角膜內(nèi)皮細(xì)胞；HRPE：人視網(wǎng)膜色素上皮；RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Figure 2 Apoptosis and cell cycle of three kinds of cells in each group analyzed by flow cytometry A:Flow cytometric analysis of apoptosis B:Flow cytometric analysis of cell cycle BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution;HCEC:human corneal endothelial cells;HRPE:human retinal pigment epithelium;RGC:retinal ganglion cells

2.2 各組細(xì)胞狀態(tài)比較

正常對(duì)照組、BSS組和CEIIS組間HRPE細(xì)胞和RGC的細(xì)胞凋亡率總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HRPE：F=37.287，P<0.001；RGC：F=7.378，P=0.024)，HCEC細(xì)胞凋亡率總體比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.919，P=0.082)。BSS組HRPE細(xì)胞和RGC的細(xì)胞凋亡率分別為(37.157±6.918)%和(29.993±12.330)%，明顯高于CEIIS組的(4.163±1.310)%和(6.337±1.903)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、0.045)；BSS組和CEIIS組HCEC細(xì)胞凋亡率分別為(16.380±8.969)%和(3.267±0.265)%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.107)(圖2A)。

正常對(duì)照組、BSS組和CEIIS組間HCEC和HRPE細(xì)胞的G0/G1+S期比例總體比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HCEC：F=2.226，P=0.189；HRPE：F=2.634，P=0.151)。各組間RGC的G2/M期比例總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.354，P=0.018)；其中BSS組RGC的G2/M期比例高于DMEM組和CEIIS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047、0.024)(圖2B)。各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)CEIIS組HCEC、HRPE細(xì)胞和RGC的增生A值均明顯高于BSS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

2.3 各組不同細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

細(xì)胞免疫熒光染色顯示，BSS組HCEC、HRPE細(xì)胞和RGC中細(xì)胞色素C、bax、caspase-3和caspase-9均呈強(qiáng)熒光表達(dá)，熒光強(qiáng)度強(qiáng)于正常對(duì)照組和CEIIS組，bcl-2熒光強(qiáng)度弱于CEIIS組；BSS組各細(xì)胞ZO-1呈弱熒光表達(dá)，熒光強(qiáng)度低于正常對(duì)照組和CEIIS組(圖3)。

2.4 各組不同細(xì)胞中LDH和SDH釋放量比較

培養(yǎng)12、24、48 h時(shí)BSS組3種細(xì)胞中LDH釋放水平均高于CEIIS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；不同時(shí)間點(diǎn)BSS組3種細(xì)胞中LDH釋放水平均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；培養(yǎng)12 h時(shí)，CEIIS組HRPE細(xì)胞、RGC中LDH釋放水平高于正常對(duì)照組，HCEC細(xì)胞中LDH釋放水平低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；培養(yǎng)24 h時(shí)，CEIIS組3種細(xì)胞LDH釋放水平均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)；培養(yǎng)48 h時(shí)，CEIIS組HCEC、HRPE細(xì)胞LDH釋放水平高于正常對(duì)照組，RGC的LDH釋放水平低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(表3)。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)3種細(xì)胞增生A值比較(mean±SD)Table 2 Comparison of proliferation absorbance value of HCEC,HRPE cells and RGC among different groups at various timepoints (mean±SD,A value)組別樣本量培養(yǎng)12 h不同細(xì)胞A值培養(yǎng)24 h不同細(xì)胞A值培養(yǎng)48 h不同細(xì)胞A值HCECHRPERGCHCECHRPERGCHCECHRPERGC正常對(duì)照組30.350±0.0360.736±0.0860.647±0.0790.435±0.0441.524±0.0611.317±0.0370.648±0.0760.939±0.1000.925±0.027BSS組30.122±0.0150.067±0.0030.188±0.0040.056±0.0030.079±0.0200.197±0.0350.060±0.0040.112±0.0150.266±0.042CEIIS組30.315±0.017b0.849±0.081b0.382±0.028ab0.225±0.020ab1.385±0.171b0.529±0.110ab0.120±0.005ab0.724±0.083ab0.870±0.109bF值76.588114.74567.304138.130170.512216.855161.44996.37683.633P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與BSS組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) HCEC:人角膜內(nèi)皮細(xì)胞;HRPE:人視網(wǎng)膜色素上皮;RGC:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;BSS:平衡鹽溶液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液 Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the BSS group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) HCEC:human corneal endothelial cells;HRPE:human retinal pigment epithelium;RGC:retinal ganglion cells;BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocu-lar irrigating solution

圖3 各組3種細(xì)胞ZO-1、bax、bcl-2、細(xì)胞色素C、caspase-3和caspase-9免疫熒光染色圖 (×200，標(biāo)尺=20 μm) BSS組各細(xì)胞中細(xì)胞色素C、bax、caspase-3和caspase-9蛋白熒光強(qiáng)度強(qiáng)于正常對(duì)照組和CEIIS組，bcl-2蛋白熒光強(qiáng)度弱于CEIIS組，ZO-1蛋白熒光強(qiáng)度弱于正常對(duì)照組和CEIIS組 BSS：平衡鹽灌洗液；CEIIS：復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液；HCEC：人角膜內(nèi)皮細(xì)胞；HRPE：人視網(wǎng)膜色素上皮；RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Figure 3 Immunofluorescence staining of three cells for ZO-1,bax,bcl-2,cytochrome c,caspase-3 and caspase-9 in each group (×200,bar=20 μm) The fluorescence intensity of cytochrome C,bax,caspase-3 and caspase-9 proteins in the BSS group was stronger than that in the normal control group and CEIIS group.The fluorescence intensity of bcl-2 protein in CEIIS group was stronger than that in the BSS group.The fluorescence intensity of ZO-1 protein in the BSS group was weaker than that in the normal control group and CEIIS group BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution;HCEC:human corneal endothelial cells;HRPE:human retinal pigment epithelium;RGC:retinal ganglion cells

培養(yǎng)12 h時(shí)，BSS組HCEC和RGC的SDH釋放水平均高于CEIIS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，BSS組HRPE細(xì)胞SDH釋放水平與CEIIS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.359)；培養(yǎng)24 h時(shí)，BSS組HCEC與HRPE細(xì)胞SDH釋放水平高于CEIIS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)，BSS組3種細(xì)胞SDH釋放水平均高于CEIIS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表4)。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)3種細(xì)胞LDH釋放量比較[mean±SD,nmol/(min·ml)]Table 3 Comparison of LDH releasing level among three kinds of cellsamong different groups at various time points[mean±SD,nmol/(min·ml)]組別樣本量培養(yǎng)12 h不同細(xì)胞釋放量培養(yǎng)24 h不同細(xì)胞釋放量培養(yǎng)48 h不同細(xì)胞釋放量HCECHRPERGCHCECHRPERGCHCECHRPERGC正常對(duì)照組3148.55±0.5779.28±0.5295.36±0.37207.54±0.7751.74±0.48219.13±0.25141.45±0.5891.88±0.96273.91±0.16BSS組3160.29±0.15a249.28±0.40a157.97±0.36a253.48±0.19a564.78±0.94a375.78±0.52a492.75±0.31a490.87±0.34a307.52±0.76aCEIIS組385.68±0.22b117.39±0.94b178.84±0.30b228.41±0.15b125.36±0.57b299.13±0.23b392.90±0.16b141.88±0.47b265.80±0.59bF值45 925.38952 918.35440 453.9638 330.496449 701.470133 857.058620 803.838307 350.0464 370.138P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與BSS組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) LDH:乳酸脫氫酶;BSS:平衡鹽灌洗液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液;HCEC:人角膜內(nèi)皮細(xì)胞;HRPE:人視網(wǎng)膜色素上皮;RGC:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the BSS group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LDH:lactate dehydro-genase;BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution;HCEC:human corneal endothelial cells;HRPE:human reti-nal pigment epithelium;RGC:retinal ganglion cells

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)3種細(xì)胞SDH釋放量比較[mean±SD,nmol/(min·ml)]Table 4 Comparison of SDH releasing level among three kinds of cells among different groups at various time points[mean±SD,nmol/(min·ml)]組別樣本量培養(yǎng)12 h不同細(xì)胞釋放量培養(yǎng)24 h不同細(xì)胞釋放量培養(yǎng)48 h不同細(xì)胞釋放量HCECHRPERGCHCECHRPERGCHCECHRPERGC正常對(duì)照組3-0.061±0.003-0.273±0.025-0.032±0.004-0.051±0.003-0.372±0.008-0.020±0.007-0.049±0.003-0.143±0.025-0.020±0.003BSS組3-0.030±0.003-0.157±0.021-0.010±0.003-0.030±0.003-0.127±0.010-0.021±0.009-0.030±0.005-0.117±0.021-0.005±0.005CEIIS組3-0.041±0.003a-0.187±0.055-0.031±0.003a-0.051±0.003a-0.220±0.072a-0.032±0.009-0.041±0.003a-0.573±0.275a-0.051±0.003aF值82.3338.05747.85552.55125.6321.93825.7167.708119.533P值<0.0010.020<0.001<0.0010.0010.2240.0010.022<0.001 注:與BSS組比較,aP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) SDH:琥珀酸脫氫酶;BSS:平衡鹽灌洗液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液;HCEC:人角膜內(nèi)皮細(xì)胞;HRPE:人視網(wǎng)膜色素上皮;RGC:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 Note:Compared with the BSS group,aP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SDH:succinate dehydrogenase;BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution;HCEC:human corneal endothelial cells;HRPE:human retinal pigment epithelium;RGC:retinal ganglion cells

2.5 各組實(shí)驗(yàn)兔手術(shù)前后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

術(shù)前BSS組和CEIIS組術(shù)眼視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)分別為(15.8±10.4)個(gè)/高倍視野和(19.8±9.1)個(gè)/高倍視野，2個(gè)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.531)；BSS組和CEIIS組中bax和細(xì)胞色素C蛋白呈弱表達(dá)。玻璃體切割術(shù)后24 h，視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞主要位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層和RGC層；細(xì)胞色素C主要表達(dá)于光感受器層。BSS組細(xì)胞色素C表達(dá)強(qiáng)于CEIIS組；bax蛋白主要表達(dá)于視網(wǎng)膜外核層，2個(gè)組間視網(wǎng)膜bax蛋白表達(dá)強(qiáng)度無明顯差別；術(shù)后BSS組視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)為(135.2±22.8)個(gè)/高倍視野，高于CEIIS組的(81.3±17.7)個(gè)/高倍視野，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.175，P=0.002)(圖4)。

圖4 各組術(shù)前及術(shù)后24 h術(shù)眼視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、細(xì)胞色素C及bax免疫組織化學(xué)染色圖(DAB ×400，標(biāo)尺=50 μm) 術(shù)前BSS組和CEIIS組術(shù)眼視網(wǎng)膜中TUNEL陽性細(xì)胞凋亡數(shù)均較低，術(shù)后BSS組視網(wǎng)膜中TUNEL陽性細(xì)胞染色明顯強(qiáng)于CEIIS組，主要位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層和RGC層。術(shù)前BSS和CEIIS組術(shù)眼視網(wǎng)膜中細(xì)胞色素C蛋白呈弱表達(dá)，術(shù)后BSS組細(xì)胞色素C表達(dá)強(qiáng)于CEIIS組，主要表達(dá)在光感受器層。術(shù)前BSS和CEIIS組術(shù)眼視網(wǎng)膜中bax蛋白呈弱表達(dá)，術(shù)后BSS組和CEIIS組視網(wǎng)膜中bax蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，且2個(gè)組間無明顯差別 BSS：平衡鹽灌洗液；CEIIS：復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液Figure 4 Immunohistochemical staining of retinal cell apoptosis,cytochrome C and bax in various groups before and 24 hours after surgery (DAB ×400,bar=50 μm) The number of apoptotic TUNEL-positive cells in the retina of the BSS group and CEIIS group were lower before operation.After operation,the TUNEL-positive cell staining in the retina of the BSS group was obviously stronger than that of the CEIIS group,which was mainly located in the inner nuclear layer and RGC layer.Before operation,cytochrome C protein was weakly expressed in the retina of BSS and CEIIS groups.After operation,the expression of cytochrome C in the BSS group was stronger than that in the CEIIS group,which mainly expressed in the photoreceptor layer.Weak expression of bax protein was found in the retina of BSS and CEIIS groups before operation,and the expression of bax protein was increased in the retina of BSS and CEIIS groups after operation,and there was no significant difference between the two groups BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

2.6 各組實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變化

BSS組術(shù)前和術(shù)后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層+內(nèi)叢狀層+內(nèi)核層厚度分別為(131.67±4.50)μm和(132.00±4.90)μm，外叢狀層+外核層厚度分別為(111.67±15.92)μm和(112.33±14.97)μm，術(shù)前與術(shù)后各厚度值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；CEIIS組術(shù)前和術(shù)后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層+內(nèi)叢狀層+內(nèi)核層厚度分別為(130.67±3.40)μm和(134.67±2.05)μm，外叢狀層+外核層厚度分別為(144.33±20.53)μm和(145±15.25)μm，術(shù)前與術(shù)后各厚度值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。術(shù)后未見視網(wǎng)膜脫離發(fā)生(圖5)。

2.7 實(shí)驗(yàn)兔視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)變化

透射電子顯微鏡檢查顯示，實(shí)驗(yàn)兔非手術(shù)眼視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)層次清楚，細(xì)胞排列致密，外核層細(xì)胞核排列規(guī)則；BSS組和CEIIS組術(shù)后術(shù)眼視網(wǎng)膜感光層細(xì)胞排列疏松，視網(wǎng)膜光感受器外節(jié)膜盤大量脫落，出現(xiàn)疊狀結(jié)構(gòu)解離和空泡變性，部分細(xì)胞核皺縮，RPE細(xì)胞色素顆粒減少，線粒體腫脹，內(nèi)膜嵴消失，出現(xiàn)空泡，以BSS組更為嚴(yán)重(圖6)。

圖5 手術(shù)前后BSS組和CEIIS組術(shù)眼視網(wǎng)膜OCT圖 術(shù)后24 h各組術(shù)眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和厚度與術(shù)前比較均無明顯變化 BSS：平衡鹽灌洗液；CEIIS：復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液Figure 5 Retinal OCT images of the BSS group and CEIIS group after operation There were no significant changes in retinal structure and thickness between before and 24 hours after operation BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

圖6 各組實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)變化 透射電子顯微鏡檢查結(jié)果證實(shí)2個(gè)組術(shù)后視網(wǎng)膜有輕微的組織學(xué)改變，術(shù)后24 h細(xì)胞密度較術(shù)前稀疏，光感受器外節(jié)膜盤大量脫落，出現(xiàn)疊狀結(jié)構(gòu)解離和空泡變性，BSS組比CEIIS組更嚴(yán)重 BSS：平衡鹽灌洗液；CEIIS：復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液Figure 6 Retinal ultrastructural changes of experimental eyes in each group after operation Slight histological changes were found in the retina of BSS and CEIIS groups after operation with a transmission electron microscope.The cell density at 24 hours after operation was sparser compared with that before operation.A large number of membrane discs in photoreceptor outer segment fell off.Dissociation of overlapped structure and the vacuolar degeneration were observed in the two groups,which were more serious in BSS group than CEIIS group BSS:balanced saline solution;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

2.8 各組實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜功能比較

術(shù)前BSS組與CEIIS組術(shù)眼a波、b波振幅值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.374、0.159)。術(shù)后24 h，BSS組術(shù)眼暗適應(yīng)0.01(cd·s/m2)ERG b波振幅較術(shù)前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)；CEIIS組術(shù)眼手術(shù)前后b波振幅比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.123)。術(shù)后24 h，BSS組術(shù)眼暗適應(yīng)3.0(cd·s/m2)ERG a、b波振幅較術(shù)前均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026、0.010)；CEIIS組兔眼術(shù)后a、b波振幅較術(shù)前均有所下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.093、0.159)。BSS組和CEIIS組術(shù)眼術(shù)后OPs波總振幅較術(shù)前均有所下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.642、0.258)。BSS組術(shù)眼術(shù)前30Hz閃爍光ERG振幅為(9.62±3.22)μV，術(shù)后降低至(1.79±1.04)μV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.777，P=0.002)，CEIIS組術(shù)眼30Hz閃光ERG振幅從術(shù)前的(9.68±5.14)μV降低至術(shù)后的(3.06±1.04)μV，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.785，P=0.149)(表5～7)。

表5 各組內(nèi)術(shù)眼手術(shù)前后暗視0.01 ERG b波振幅比較(mean±SD,μV)Table 5 Comparison of preoperative and postoperative scotopic0.01 ERG b-wave amplitude in each group (mean±SD,μV)時(shí)間樣本量BSS組b波CEIIS組b波術(shù)前338.97±17.9288.97±51.78術(shù)后316.43±4.3217.15±5.74t值2.5702.107P值0.0370.123 注:(配對(duì)t檢驗(yàn))ERG:視網(wǎng)膜電圖;BSS:平衡鹽灌洗液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液 Note:(Paired t-test) ERG:electroretinogram;BSS:balanced saline solu-tion;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

表6 各組內(nèi)術(shù)眼手術(shù)前后暗視3.0 ERG a、b波振幅比較(mean±SD,μV)Table 6 Comparison of preoperative and postoperativescotopic 3.0 ERG a- and b-wave amplitudes in eachgroup (mean±SD,μV)時(shí)間樣本量BSS組CEIIS組a波b波a波b波術(shù)前340.17±25.1471.63±25.0950.23±16.90115.7±45.84術(shù)后36.51±4.5126.58±7.9923.90±1.4956.3±16.17t值2.8033.5362.2131.592P值0.0260.0100.0930.159 注:(配對(duì)t檢驗(yàn))ERG:視網(wǎng)膜電圖;BSS:平衡鹽灌洗液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液 Note:(Paired t-test) ERG:electroretinogram;BSS:balanced saline solu-tion;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

表7 各組內(nèi)術(shù)眼手術(shù)前后明視3.0 ERG a、b波振幅比較(mean±SD,μV)Table 7 Comparison of preoperative and postoperativephotopic 3.0 ERG a- and b-wave amplitudes in eachgroup (mean±SD,μV)時(shí)間樣本量BSS組CEIIS組a波b波a波b波術(shù)前37.91±5.2557.27±20.8812.29±5.7995.17±43.34術(shù)后36.01±2.3520.83±5.233.13±2.5325.90±4.68t值0.6581.8872.0512.247P值0.5320.1570.1100.088 注:(配對(duì)t檢驗(yàn))ERG:視網(wǎng)膜電圖;BSS:平衡鹽灌洗液;CEIIS:復(fù)方電解質(zhì)眼內(nèi)灌注液 Note:(Paired t-test) ERG:electroretinogram;BSS:balanced saline solu-tion;CEIIS:compound electrolyte intraocular irrigating solution

3 討論

由于玻璃體切割術(shù)有導(dǎo)致眼內(nèi)炎癥的風(fēng)險(xiǎn)或?qū)σ暰W(wǎng)膜功能的恢復(fù)產(chǎn)生影響，因此術(shù)中選擇最佳的眼內(nèi)灌注溶液對(duì)術(shù)眼視覺質(zhì)量和患者生活質(zhì)量的改善至關(guān)重要。0.9%氯化鈉溶液、BSS、透明質(zhì)酸鹽和硅油等均可作為玻璃體切割術(shù)的眼內(nèi)填充物[8-10]，但從理論上講CEIIS所含成分更接近視網(wǎng)膜及其他眼組織代謝所需組分。

HCEC、HRPE細(xì)胞和RGC對(duì)玻璃體切割術(shù)后視覺功能的恢復(fù)至關(guān)重要。本研究采用BSS和CEIIS對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BSS和CEIIS對(duì)這些細(xì)胞的增生活力均有一定的影響，但CEIIS條件下的細(xì)胞活力優(yōu)于BSS。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法證實(shí)BSS組細(xì)胞ZO-1的表達(dá)水平明顯低于CEIIS組，推測(cè)主要是由BSS中碳酸氫鹽和葡萄糖成分缺失所致。此外，3種細(xì)胞對(duì)葡萄糖成分的敏感性有所不同，HRPE細(xì)胞反應(yīng)最為敏感，推測(cè)HRPE細(xì)胞對(duì)碳酸氫鹽和葡萄糖的依賴性可能高于其他細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，碳酸氫鹽對(duì)維持正常視網(wǎng)膜功能是必不可少的，葡萄糖在維持細(xì)胞活力、減少凋亡、維持細(xì)胞周期、保持細(xì)胞間的正常連接和通訊、減少氧化還原介導(dǎo)的損傷及維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能等方面尤為重要，這可能是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中CEIIS組細(xì)胞活性好、損傷小的主要原因[11-13]。

為了驗(yàn)證離體實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，本研究進(jìn)行了相應(yīng)的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示玻璃體切割術(shù)后視網(wǎng)膜的OCT影像未見明顯變化。然而，透射電子顯微鏡下觀察可見術(shù)后視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，本研究結(jié)果與孟自軍等[14]和Hasumura等[15]的研究結(jié)果一致。Terasaki[16]研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體切割術(shù)術(shù)中填充液釋放到玻璃體中的化學(xué)介質(zhì)可引起視網(wǎng)膜功能下降，OCT檢查結(jié)果也提示視網(wǎng)膜厚度的減少有助于其功能恢復(fù)。然而，本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)手術(shù)前后視網(wǎng)膜厚度變化。

本研究采用閃光ERG檢查評(píng)估實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜功能，結(jié)果顯示BSS組和CEIIS組術(shù)眼均可見視網(wǎng)膜內(nèi)層和外層損傷，表現(xiàn)為玻璃體切割術(shù)后a波和b波振幅明顯降低。有研究報(bào)道，玻璃體切割術(shù)后皮質(zhì)可能會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜產(chǎn)生直接損害作用，尤其是神經(jīng)纖維層，同時(shí)也會(huì)影響視盤的血液供應(yīng)[17]，與本研究中離體細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。有研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體切割術(shù)后視網(wǎng)膜早期的損傷，如內(nèi)界膜脫落缺損或丟失、視神經(jīng)纖維層外露、內(nèi)叢狀層和內(nèi)核層水腫等主要發(fā)生于視網(wǎng)膜內(nèi)層[15-18]。此外，術(shù)后并發(fā)癥，如暫時(shí)性視網(wǎng)膜水腫和暫時(shí)性視網(wǎng)膜代謝狀態(tài)的紊亂最終導(dǎo)致ERG結(jié)果的改變。

本研究結(jié)果提示玻璃體切割術(shù)會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層造成影響。研究發(fā)現(xiàn)BSS組實(shí)驗(yàn)眼暗適應(yīng)3.0刺激下a波、b波振幅低于CEIIS組，既往用空氣或硅油代替眼內(nèi)介質(zhì)以及在眼壓急劇升高的時(shí)期也同樣觀察到了可逆的振幅降低[19]。然而，ERG結(jié)果顯示，玻璃體切割術(shù)中使用不同成分的眼內(nèi)介質(zhì)時(shí)，術(shù)后視網(wǎng)膜的功能也會(huì)存在差異。Mizote等[20]和Hirooka等[21]研究發(fā)現(xiàn)兔眼玻璃體切割術(shù)中壓力引起的視網(wǎng)膜缺血后7 d，RGC數(shù)量減少，視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層厚度下降，而玻璃體切割術(shù)中用D-allose進(jìn)行眼內(nèi)沖洗可保護(hù)視網(wǎng)膜免受缺血損傷。本研究結(jié)果也顯示，玻璃體切割術(shù)后用含有葡萄糖成分的CEIIS進(jìn)行眼內(nèi)灌注后ERG各波振幅較不含葡萄糖成分的BSS更高，這可能是由于葡萄糖可為視網(wǎng)膜代謝提供能量，從而保護(hù)視網(wǎng)膜免受早期損傷所致。因此，在玻璃體切割中使用含有葡萄糖成分的眼內(nèi)灌注溶液有助于視網(wǎng)膜功能的恢復(fù)。

玻璃體切割術(shù)后視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不會(huì)發(fā)生明顯改變[17-18]。本研究中離體細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CEIIS和BSS眼內(nèi)灌注液對(duì)眼組織細(xì)胞的影響有明顯差異，而在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后短時(shí)間內(nèi)視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)未見明顯差異，表明在體內(nèi)這種應(yīng)激可能引發(fā)了更為復(fù)雜和有效的保護(hù)機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，玻璃體切割術(shù)中CEIIS灌注液的應(yīng)用對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用優(yōu)于BSS灌注液，灌注液中碳酸氫鹽和葡萄糖成分可能在玻璃體切割術(shù)中起到重要作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突