骨髓來源樹突狀細胞miR-338-3p對實驗性自身免疫性葡萄膜炎Th17細胞活化的影響

楊超 韋燕凱 魏瑞華 粘紅

天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學眼視光學院 天津醫(yī)科大學眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學研究中心天津市分中心 天津市視網膜功能與疾病重點實驗室 300384

自身免疫性葡萄膜炎是一類易復發(fā)、難治性眼內炎性疾病，控制不當可導致視力損傷，甚至致盲[1]。實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠是自身免疫性葡萄膜炎的經典動物模型，其與人類葡萄膜炎在臨床表現(xiàn)及分子機制上具有很大的相似性，在研究自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機制中扮演重要角色[2]。目前研究認為Th17細胞、白細胞介素(interleukin，IL)-23/IL-17通路是自身免疫性葡萄膜炎發(fā)生的重要機制[3-6]。Th17細胞分化依賴于抗原提呈細胞的刺激和微環(huán)境中細胞因子的調控，而樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)作為專職抗原提呈細胞，可誘導T細胞活化，同時分泌IL-6、IL-23和IL-1β等細胞因子，促進Th17細胞的增生分化[7-8]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類約22個核苷酸的短鏈非編碼RNA，可以在轉錄后水平調控基因表達[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以通過調控DCs影響Th17細胞的反應[10-12]。miR-338-3p是一種高度保守的miRNA，具有免疫調控作用[13-15]。然而，miR-338-3p對Th17細胞的調控作用尚未見報道。本課題組前期研究結果顯示，miR-338-3p在EAU小鼠脾臟細胞中表達明顯升高。進一步分析GSE144081數(shù)據集發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在DCs中的表達豐度明顯高于CD4+T細胞。因此，本研究擬探討骨髓來源DCs(bone marrow-derived DCs，BMDCs)中miR-338-3p對EAU IRBP1-20特異性Th17細胞活化的影響以及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級8～10周齡健康雌性C57BL/6J小鼠，體質量(20.1±1.3)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗前排除眼部疾病及其他異常。實驗動物的飼養(yǎng)及操作符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的規(guī)定，并獲得天津醫(yī)科大學動物管理及使用委員會的批準(批文號：TJYY2019110117)。

1.1.2主要試劑及儀器 miR-338-3p擬似物、擬似物陰性對照、miR-338-3p 抑制劑、抑制劑陰性對照(上海吉瑪生物科技有限公司)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、重組小鼠細胞因子IL-4、重組小鼠細胞因子IL-23和小鼠IL-17 ELISA試劑盒(美國R&D公司)；IRBP1-20多肽片段、實時熒光定量PCR引物(上海生物工程股份有限公司)；結核分枝桿菌H37RA(美國Difco公司)；弗氏不完全佐劑(incomplete Freund adjuvant，IFA)、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、布雷菲爾得菌素A(brefeldin A，BFA)、鈣離子霉素(美國Sigma公司)；固定劑、破膜劑、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的大鼠抗小鼠IL-17流式抗體(FITC-IL-17)、巰基化藻紅蛋白(sulfhydryl phycoerythrin，PE)標記的大鼠抗小鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)流式抗體(PE-IFN-γ)(美國Biolegend公司)；Lipofectamine 2000、逆轉錄試劑盒、SYBR Green 2倍Master Mix(美國Thermo公司)。7900HTFAST 實時熒光定量PCR儀(愛普拜斯應用生物系統(tǒng)貿易上海有限公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1BMDCs的制備 斷頸法處死小鼠，于無菌操作臺分離出股骨和脛骨，置于含RPMI-1640培養(yǎng)基的皿中，用1 ml無菌注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白；將沖洗下來的骨髓細胞懸液經無菌棉花柱過濾，以除去殘留的骨碎片及肌肉組織，濾液于4 ℃條件下，離心半徑16.8 cm,1 264 r/min,離心8 min，棄去上清液，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞；將細胞以1×106/ml密度接種于24孔板，加入終濃度10 ng/ml GM-CSF及IL-4誘導骨髓細胞向DCs分化；培養(yǎng)第3天半量換液，補充細胞因子，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天得到未成熟的BMDCs。

1.2.2EAU模型的建立及T細胞的提取 小鼠腹腔內注射350 ng百日咳毒素后2 h，于單后足和軀干部皮下注射100 μl含有150 μg IRBP1-20、0.8 mg結核分枝桿菌H37RA和IFA的乳化劑，建立EAU模型；于造模后第13天，斷頸法處死小鼠，取脾臟及腘窩淋巴結研磨，將研磨液經棉花柱過濾得到脾臟及淋巴結單細胞懸液；將細胞懸液加入尼龍柱密封，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，用完全培養(yǎng)基沖洗尼龍柱，收集沖洗下的細胞懸液得到T細胞。

1.2.3BMDCs的轉染及其與T細胞的共培養(yǎng) 收集誘導培養(yǎng)第5天的BMDCs，分為miR-338-3p擬似物轉染組、擬似物陰性對照組、miR-338-3p抑制劑轉染組和抑制劑陰性對照組；用RPMI-1640培養(yǎng)基分別將miR-338-3p擬似物、擬似物陰性對照、miR-338-3p抑制劑、抑制劑陰性對照及Lipofectamine 2000稀釋，常溫下孵育5 min，將miR-338-3p擬似物、擬似物陰性對照、miR-338-3p抑制劑和抑制劑陰性對照稀釋液分別與Lipofectamine 2000稀釋液混合，常溫下靜置20 min，分別加入各組BMDCs中，培養(yǎng)6 h后補充完全培養(yǎng)基；轉染24 h，加入終質量濃度100 ng/ml的脂多糖刺激各組BMDCs，培養(yǎng)24 h后收集細胞，一部分BMDCs用于提取總RNA，另一部分BMDCs以1×105/孔分別接種于24孔板，在含有10 μg/ml IRBP1-20的完全培養(yǎng)基中與分離的脾臟及淋巴結T細胞共培養(yǎng)，并加入終質量濃度為20 ng/ml的IL-23(Th17細胞極化條件)，培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液及細胞用于后續(xù)研究。

1.2.4ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度 取各組共培養(yǎng)上清液，根據小鼠IL-17 ELISA試劑盒說明書檢測IL-17質量濃度。取酶標板孔用IL-17捕獲抗體常溫包被過夜，封閉液常溫封閉1 h；實驗孔加入10倍稀釋的樣本100 μl，標準品孔加入梯度稀釋的標準品100 μl，常溫孵育2 h，棄去液體，清洗5次；每孔加入稀釋的IL-17檢測抗體100 μl，常溫孵育2 h，棄去液體，清洗5次；每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶，常溫孵育30 min，棄去液體，清洗5次；每孔加入100 μl四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)顯色液，室溫孵育10～20 min；每孔加50 μl終止液，測定450 nm處吸光度(A)值，用540 nm處A值進行校正；根據標準品濃度和A值繪制標準曲線，得出標準曲線直線回歸方程，計算樣本IL-17質量濃度。

1.2.5實時熒光定量PCR法檢測BMDCs中miR-338-3p、IL-23、IL-1β、IL-6 mRNA和共培養(yǎng)細胞中IL-17、RORγt mRNA相對表達量 采用Trizol法提取miR-338-3p 擬似物轉染組和擬似物陰性對照組BMDCs以及共培養(yǎng)細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉為cDNA，以cDNA為模板，各基因引物序列見表1，進行實時熒光定量PCR。PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，40個循環(huán)。以GAPDH為內參照，用2-ΔΔCt法計算BMDCs中IL-23、IL-1β、IL-6 mRNA以及共培養(yǎng)細胞中IL-17、RORγt mRNA相對表達量。另取miR-338-3p擬似物轉染組和擬似物陰性對照組BMDCs檢測miR-338-3p相對表達量，反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火及延伸40 s，40個循環(huán)。以U6為內參照，采用2-ΔΔCt法計算2個組BMDCs中miR-338-3p相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR基因引物序列(5’-3’)擴增長度(bp)IL-17F:CCTGGCGGCTACAGTGAAG57R:TTTGGACACGCTGAGCTTTGRORγtF:CCTCAGCGCCCTGTGTTTT58R:GCATGCAGCTTTTGCCTGTTIL-23F:CATAGCTGCCCGGGTCTTT57R:GGCACTAAGGGCTCAGTCAGAIL-1βF:AGTTGACGGACCCCAAAAGA57R:GGACAGCCCAGGTCAAAGGIL-6F:CCACGGCCTTCCCTACTTC61R:TTGGGAGTGGTATCCTCTGTGAGAPDHF:CATGGCCTTCCGTGTTCCTA55R:GCGGCACGTCAGATCCA 注:PCR:聚合酶鏈式反應;IL:白細胞介素;RORγt:維甲酸相關核孤兒受體γt;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶;F:正向引物;R:反向引物 Note:PCR:polymerase chain reaction;IL:interleukin;RORγt:retinoic acid receptor-related orphan nuclear receptor γt;GAPDH:glyceraldehyde phosphated dehydrogenase;F:forward primer;R:reverse primer

1.2.6流式細胞儀檢測共培養(yǎng)細胞中Th17細胞百分比 取收集的miR-338-3p擬似物轉染組和擬似物陰性對照組細胞，用含有50 ng/ml PMA、1 μg/ml BFA和1 μg/ml鈣離子霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中刺激4 h；更換為破膜固定液，于4 ℃條件下避光過夜；用2.4G2封閉細胞表面Fc受體；加入FITC-IL-17、PE-IFN-γ抗體，于4 ℃避光條件下孵育2 h；洗滌細胞，流式細胞儀檢測IL-17+細胞百分比。

1.3統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。測量指標的數(shù)據資料經Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以mean±SD表示。各組間測量指標差異比較采用獨立樣本t檢驗。采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 擬似物陰性對照組與miR-338-3p擬似物轉染組BMDCs中miR-338-3p相對表達量比較

實時熒光定量PCR結果顯示，與擬似物陰性對照組相比，miR-338-3p擬似物轉染組BMDCs中miR-338-3p相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.861，P=0.002)(表2)。

表2 2個組BMDCs中miR-338-3p相對表達量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of relative expression level of miR-338-3pin BMDCs between the two groups (mean±SD)組別樣本量miR-338-3p相對表達量擬似物陰性對照組31.00±0.03miR-338-3p擬似物轉染組31 750.00±254.90t值6.861P值0.002 注:(獨立樣本t檢驗) BMDCs:骨髓來源樹突狀細胞;miR:微小RNA Note:(Independent samples t-test) BMDCs:bone marrow-derived dendritic cells;miR:microRNA

2.2 擬似物陰性對照組與miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)細胞中RORγt、IL-17 mRNA相對表達量比較

miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)細胞中RORγt、IL-17 mRNA相對表達量分別為1.34±0.16和1.33±0.16，明顯高于擬似物陰性對照組的1.00±0.01和1.00±0.01，差異均有統(tǒng)計學意義(t=3.632，P=0.022；t=3.681，P=0.021)(圖1)。

圖1 擬似物陰性對照組與miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)細胞中RORγt、IL-17 mRNA相對表達量比較 A：各組RORγt mRNA相對表達量比較 B：各組IL-17 mRNA相對表達量比較 與擬似物陰性對照組相比，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) 1：擬似物陰性對照組；2：miR-338-3p擬似物轉染組 RORγt：維甲酸相關核孤兒受體γt；IL：白細胞介素Figure 1 Comparison of the relative expression levels of RORγt and IL-17 mRNA in co-cultured cells between the two groups A：RORγt B：IL-17 Compared with the mimics negative control group,aP<0.05 (Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group RORγt：retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt；IL：interleukin

2.3 各組細胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度比較

miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度為(5 941.00±452.40)pg/ml，明顯高于擬似物陰性對照組的(4 299.00±348.30)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.979，P=0.008)(圖2)；miR-338-3p抑制劑轉染組共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度為(3 092.00±200.90)pg/ml，明顯低于抑制劑陰性對照組的(4 063.00±131.50)pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.005，P=0.002)(圖3)。

圖4 擬似物陰性對照組與miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)細胞中IL-17+細胞百分比比較 A：各組共培養(yǎng)細胞流式散點圖 B：各組共培養(yǎng)細胞中IL-17+細胞百分比比較 與擬似物陰性對照組相比，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) 1：擬似物陰性對照組；2：miR-338-3p擬似物轉染組 IFN-γ：γ-干擾素；IL：白細胞介素Figure 4 Comparison of IL-17+cells percentage in the co-cultured cells between the two groups A：Flow cytometry scatter plots of the co-cultured cells in the two groups B：Comparison of IL-17+ cells percentage in the co-cultured cells between the two groups Compared with the mimics negative control group, aP<0.05 (Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group IFN-γ：interferon-γ；IL：interleukin

圖5 擬似物陰性對照組與miR-338-3p擬似物轉染組BMDCs中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA相對表達量比較 A：各組IL-6 mRNA相對表達量比較 B：各組IL-23 mRNA相對表達量比較 C：各組IL-1β mRNA相對表達量比較 與擬似物陰性對照組相比，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) 1：擬似物陰性對照組 2：miR-338-3p擬似物轉染組 IL：白細胞介素Figure 5 Comparison of the relative expression levels of IL-6，IL-23，IL-1β mRNA in BMDCs between the two groups A：IL-6 B：IL-23 C：IL-1β Compared with the mimics negative control group, aP<0.05 (Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group IL：interleukin

2.4 擬似物陰性對照組和miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)細胞中IL-17+細胞百分比比較

miR-338-3p擬似物轉染組共培養(yǎng)細胞中IL-17+細胞百分比為(8.03±1.35)%，明顯高于擬似物陰性對照組的(4.52±0.73)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.968，P=0.017)(圖4)。

2.5 擬似物陰性對照組與miR-338-3p擬似物轉染組BMDCs中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA相對表達量比較

miR-338-3p擬似物轉染組BMDCs中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA相對表達量分別為2.23±0.21、2.21±0.56和2.32±0.43，明顯高于擬似物陰性對照組的1.00±0.06、1.00±0.07和1.01±0.15，差異均有統(tǒng)計學意義(t=10.290，P=0.001；t=3.747，P=0.020；t=5.280，P=0.006)(圖5)。

圖2 擬似物陰性對照組和miR-338-3p擬似物轉染組細胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度比較 與擬似物陰性對照組相比，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=3) 1：擬似物陰性對照組；2：miR-338-3p擬似物轉染組 IL：白細胞介素 圖3 抑制劑陰性對照組和miR-338-3p抑制劑轉染組細胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度的比較 與抑制劑陰性對照組相比，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=3) 1：抑制劑陰性對照組；2：miR-338-3p抑制劑轉染組 IL：白細胞介素Figure 2 Comparison of IL-17 concentration in co-cultured supernatant between the two groups Compared with the mimics negative control group, aP<0.01(Independent samples t-test，n=3) 1：mimics negative control group；2：miR-338-3p mimics transfection group IL：interleukin Figure 3 Comparison of IL-17 concentration in co-cultured supernatant between the two groups Compared with the inhibitor negative control group，aP<0.01 (Independent samples t-test，n=3) 1：inhibitor negative control group；2：miR-338-3p inhibitor transfection group IL：interleukin

3 討論

Th17細胞是一類CD4+T細胞亞群，特異性表達轉錄因子RORγt，通過分泌IL-17等炎性細胞因子促進自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。研究表明，自身免疫性葡萄膜炎患者體內Th17細胞活性增強，血清中IL-17水平上升，靶向抑制Th17細胞可以緩解患者眼部炎癥[18-20]。因此，深入研究Th17細胞的相關調控機制對自身免疫性葡萄膜炎的防治具有重要意義。目前多個研究團隊揭示T細胞內源性通路影響Th17細胞反應[21-23]，而來自固有免疫細胞的外源信號對Th17細胞活性的影響及機制尚不清楚。Ifergan等[10]研究表明，敲除miR-223的DCs中IL-6、IL-23和IL-1β分泌減少，導致CD4+T細胞向Th17細胞方向分化減少，從而緩解了實驗性自身免疫性腦脊髓炎的癥狀，提示miRNA可以調控DCs介導的Th17細胞反應，參與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究中觀察了miR-338-3p對EAU中IRBP1-20特異性Th17細胞活化以及BMDCs促炎性細胞因子表達的影響，結果表明miR-338-3p可能通過促進BMDCs中IL-6、IL-1β和IL-23等基因的表達來增強IRBP1-20特異性Th17細胞中RORγt的表達及IL-17的產生。

編碼miR-338-3p的基因位于凋亡相關酪氨酸激酶的第7個內含子中，最初發(fā)現(xiàn)其在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮作用[24]。近年來，大量研究表明miR-338-3p在腫瘤的發(fā)生中扮演重要角色。miR-338-3p被證實在胃癌、骨肉瘤、卵巢癌等多種腫瘤組織中表達下調，且可以通過影響MAPK、PI3K/AKT等細胞內信號通路抑制腫瘤細胞的生長[25-27]。最近，miR-338-3p被證實在尋常型天皰瘡、重癥肌無力和肌萎縮側索硬化癥等多種自身免疫性疾病外周血單個核細胞中表達升高，并且與疾病嚴重程度相關[28-30]。此外，Xu等[15]的最新研究表明在尋常型天皰瘡中，miR-338-3p可以通過靶向RUNX1來抑制FOXP3的表達，從而減少CD4+T細胞向調節(jié)性T細胞分化。然而，miR-338-3p在EAU中對Th17細胞的作用尚未見報道。本研究結果表明，miR-338-3p過表達的BMDCs能夠促進Th17細胞中RORγt以及IL-17 mRNA表達，提示DCs中miR-338-3p可以促進IRBP1-20特異性Th17細胞反應。流式細胞術分析結果顯示，miR-338-3p擬似物轉染組細胞共培養(yǎng)中Th17細胞比例明顯高于擬似物陰性對照組，進一步表明miR-338-3p過表達的BMDCs能夠促進IRBP1-20特異性Th17細胞分化。此外，miR-338-3p擬似物轉染組細胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度明顯高于擬似物陰性對照組，而miR-338-3p抑制劑轉染組細胞共培養(yǎng)上清液中IL-17質量濃度較抑制劑陰性對照組明顯降低，表明BMDCs中miR-338-3p能夠正向調控IL-17蛋白水平的表達。以上結果均提示miR-338-3p可能參與EAU的發(fā)病。

Th17細胞的分化依賴于局部細胞因子環(huán)境。研究表明，IL-6可以抑制T細胞中Foxp3的表達，解除RORγt抑制，從而促進Th17細胞分化；IL-1β促進Th17細胞的早期分化；而IL-23維持Th17細胞的穩(wěn)定，是產生致病性Th17細胞的關鍵細胞因子[31]。DCs是專職抗原提呈細胞，活化的DCs能夠分泌IL-6、IL-23和IL-1β等多種細胞因子，指導CD4+T細胞亞群分化，調控抗原特異性免疫反應[32-33]。有研究表明，miRNA能夠通過調控DCs促炎性或抑炎性細胞因子的分泌從而影響Th17細胞的活性[34]。例如，克羅恩病患者DCs中miR-29的減少導致IL-23水平升高，促進了Th17細胞中RORγt和IL-17 mRNA的表達[35]。此外，Kurowska-Stolarska等[12]研究表明miR-34a-/-DCs分泌IL-6、IL-1β、IL-23減少，導致抗原特異性Th17細胞產生減少，從而緩解了抗原誘導的關節(jié)炎。而miR-155過表達能夠抑制DCs中IL-6、IL-1β的分泌，促進IL-10的表達，抑制白塞病患者CD4+T細胞中IL-17的產生[36]。本研究結果顯示，與擬似物陰性對照組相比，轉染miR-338-3p擬似物的BMDCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA的表達水平明顯升高，表明miR-338-3p可能通過DCs創(chuàng)造了有利于Th17細胞活化的微環(huán)境。

綜上所述，本研究結果表明miR-338-3p可能通過促進BMDCs分泌Th17細胞極化相關細胞因子來增強IRBP1-20特異性Th17細胞的活性，進而影響EAU的發(fā)生和發(fā)展。然而，本研究僅在體外探討了BMDCs中miR-338-3p對Th17細胞的調控作用及部分機制，而在體環(huán)境復雜，DCs中miR-338-3p如何影響EAU中致病性Th17細胞的活化以及miR-338-3p是通過何種胞內通路影響Th17細胞的活性仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突