重組人IL-17A 在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響

母潤(rùn)紅, 艾一玖, 李雨澎, 林 睿, 葉思萍, 馬 方, 郭 笑，

（1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013；4.吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132013）

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，探討胃癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和新的治療方案的研究一直備受關(guān)注。研究［1-2］顯示：炎癥與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在腫瘤微環(huán)境中，炎癥通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤組織遺傳學(xué)改變，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤增大。白細(xì)胞介素IL-17（interleukin-17，IL-17）家族成員包含IL-17A～I(xiàn)L-17F 共6個(gè)成員，其中白細(xì)胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）是最受關(guān)注、最具有標(biāo)志性的Th17 細(xì)胞因子，在慢性炎癥和自身免疫性疾病的病理過(guò)程中起重要作用。研究［3］顯示：IL-17 存在于多種炎癥相關(guān)性腫瘤患者體內(nèi)，并且IL-17A 對(duì)癌癥起始過(guò)程中癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起至關(guān)重要的作用，但其作用機(jī)制尚未明確。HUANG等［4］研究顯示：IL-17A 可通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和刺激肺腺癌生成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）從而促進(jìn)腫瘤血管生成；在結(jié)腸癌和肝癌組織標(biāo)本中，IL-17A 表達(dá)水平升高與患者預(yù)后不良有關(guān)［5］；在患有卵巢癌的患者中發(fā)現(xiàn)IL-17A低表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)［6］；研究［7-8］顯示：IL-17A 與鼻咽癌和肺癌的發(fā)生發(fā)展亦有關(guān)聯(lián)。由此可見(jiàn)，IL-17A 對(duì)眾多腫瘤的進(jìn)展和治療均可產(chǎn)生影響，然而目前IL-17A 與胃癌的關(guān)系尚未明確，關(guān)于其作用機(jī)制的研究較少。本研究首先檢測(cè)IL-17A 在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率及其與白細(xì)胞介素17受體A（interleukin-17 receptor A ，IL-17RA）的相關(guān)性，觀察IL-17A蛋白對(duì)胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響，進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，從新的角度揭示胃癌發(fā)病的免疫分子機(jī)制，為胃癌的診療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月—2016年12月北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科30例原發(fā)性胃癌術(shù)后石蠟標(biāo)本和20例腸上皮化生的胃組織標(biāo)本，10例正常胃組織標(biāo)本由吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院病理科提供。胃癌患者男性16例，女性14例，年齡38～79歲，平均年齡為（64±3）歲。所有患者經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)確診且術(shù)前均未接受放化療。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器人胃癌BGC-823 細(xì)胞株（北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫實(shí)驗(yàn)室保存）。RPMI-1640和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），Lipofectamine?2000（美國(guó)Invitrogen 公司），RIPA裂解液（上海Beyotime 公司），抗人IL-17A 單克隆抗體（美國(guó)Novusiological 公司），抗人IL-17RA 單克隆抗體（美國(guó)Abcam 公司）和PV-6000 通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物公司）。Western blotting 電泳設(shè)備（美國(guó)Bio-Rad 公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將人胃癌BGC-823 細(xì)胞置于含10% 胎牛血清和1% 雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 傳代1次。

1.4 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌、腸上皮化生和正常胃組織 中IL-17A 和IL-17RA 的表達(dá)情況，采用Pearson 相關(guān)分析法分析3種組織中IL-17A 與和IL-17RA 表達(dá)的關(guān)系。制備石蠟標(biāo)本切片，厚度為5 μm，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以PBS 作為陰性對(duì)照。雙盲法判定染色結(jié)果，以細(xì)胞漿或細(xì)胞核顯示棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果判定依照文獻(xiàn)［9］。

1.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823 細(xì)胞，在96孔板中每孔加入100μL 培養(yǎng)液（8×104個(gè)/孔），37℃孵育過(guò)夜，分別加入不同濃 度（50、100 和200 μ g·L－1）IL-17A ，作為IL-17A組，對(duì)照組（0 μmol·L－1IL-17A）加入等體積DMSO，5個(gè)復(fù)孔，持續(xù)培養(yǎng)24、48 和72 h后取出培養(yǎng)板，向各孔加入10 μL MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清培養(yǎng)液。每孔加入200 μL DMSO。采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm 處讀取吸光度（A）值，以A 值表示細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823 細(xì)胞，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于12 孔板中，培養(yǎng)24h后，PBS 緩沖液洗滌2次，加 入50、100 和200 μ g·L－1IL-17A ，培 養(yǎng)48 h，混勻，取250 μL 細(xì)胞于標(biāo)記好的流式管中，空白組調(diào)電壓，采用ddH2O 稀釋重懸細(xì)胞，流式管中輕輕加入1 μL FITC Annexin Ⅴ渦旋細(xì)胞，室溫避光孵育10 min。另一單染組和實(shí)驗(yàn)組各加入1 μL PI 溶 液，隨后采用100μL 1×Binding Buffer溶液重懸，輕輕渦旋，上機(jī)檢測(cè)，最后采用FlowJo V10分析數(shù)據(jù)并繪圖。

1.7 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)和劃實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)：細(xì)胞經(jīng)48h分組處理后，采用胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，取細(xì)胞密度為1×105mL－1，取200 μL 加入Transwell 上室，Transwell 下室加 入含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。200 倍視野鏡下觀察計(jì)數(shù)：選擇5個(gè)區(qū)域檢測(cè)侵襲細(xì)胞數(shù)，并取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率：6 孔板中加入細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，37℃、5% 細(xì)胞培養(yǎng)24h后，采用無(wú)菌移液器槍頭做直線劃痕，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為48 h，取出，拍照。細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度－48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中VGEF、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、B細(xì)胞淋巴 瘤2（B lymphocytoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白表達(dá)水平各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后收集，采用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌2次。加入100 μL RIPA裂解液，4℃、30 min 孵育，離心收集上清液。采用BCA 法測(cè)定細(xì)胞中總蛋白濃度，上樣量為50 μg，以10% SDS-PAGE 電泳1 h，半濕轉(zhuǎn)法將膠內(nèi)蛋白質(zhì)印跡到PVDF 膜上，含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉膜室溫放置1h。棄封閉液，加入抗體VEGF（1∶200）、MMP-9（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶500）抗體于4℃孵育過(guò)夜。取出TBST 洗滌3次，加入HRP 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000 ）室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光顯色并拍照，以GAPDH 為內(nèi)參對(duì)各組蛋白進(jìn)行灰度值分析，每組蛋白重復(fù)3次。目的蛋白表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。胃癌組織、腸上皮化生組織和正常胃組織中IL-17A 及IL-17RA陽(yáng)性表達(dá)率，各組BGC-823 細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率及細(xì)胞中VEGF、MMP-9、Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s 表示，組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。胃癌組織中IL-17A 與IL-17RA 表達(dá)的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種組織中IL-17A 和IL-17RA 陽(yáng)性表達(dá)率免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示：腸上皮化生組織和胃癌組織中IL-17A 陽(yáng)性表達(dá)率分別為（6.289±1.274）% 和（9.494±1.808）%，較正常胃組織（1.945%±1.275%）均升高（P＜0.01）；腸上皮化生組織和胃癌組織中IL-17RA 陽(yáng)性表達(dá)率分別為（3.883±1.184）% 和（8.836±5.569）%，較正常胃組織（2.886%±1.587%）均 升 高（P＜0.01）。在胃癌組織中IL-17A 和IL-17RA 主要表達(dá)于腺上皮、單核細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞中。見(jiàn)圖1。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果表明：胃癌組織中IL-17A 和IL-17RA 的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.891，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中IL-17A 與IL-17A 表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between expressions of IL-17A and IL-17RA in gastric cancer tissue

圖1 不同組織中IL-17A 和IL-17RA 的表達(dá)（免疫組織化學(xué),×200）Fig.1 Expressions of IL-17A and IL-17RA in different kinds of tissues（Immunohistochemistry,×200）

2.2 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖活性MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示：IL-17A 在50～200 μg·L－1范圍內(nèi)呈濃度依賴性促進(jìn)胃癌BGC-823 細(xì)胞增殖。作用48 和72h后，與對(duì)照組（0 μg·L－1IL-17A組）比較，100 和200 μg·L－1IL-17A組 胃 癌BGC-823細(xì)胞增殖活性明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞的增殖活性Tab.2 Proliferation activities of gastric cancer BGC-823 cells in various groups (n=3，xˉ±s）

2.3 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè) 結(jié) 果顯示： 100 和200 μg·L－1IL-17A組胃癌BGC-823 細(xì)胞凋亡率分別為（20.15±2.10）%和（10.87±3.30）%，與對(duì)照組（37.30%±2.60%）比較明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of BGC-823 cells in various groups

2.4 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著IL-17A 濃度 升 高，BGC-823細(xì)胞侵襲數(shù)增加，100 和200 μg·L－1IL-17A組細(xì)胞侵襲數(shù)分別為（82.6±4.2）個(gè)和（113.4±5.8）個(gè)，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（33.0±5.1）個(gè)，100 和200 μg·L－1IL-17A組細(xì)胞侵襲數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Transwell 小室法檢測(cè)各組胃癌BGC-823 細(xì)胞侵襲形態(tài)表現(xiàn)（結(jié)晶紫，×200）Fig.3 Invasion morphology of BGC-823 cells in various groups detected by Transwell assay（Crystal violet,×200）

2.5 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞遷移率100 和200 μg·L－1IL-17A組細(xì)胞遷移率分別為（45.4±4.2）% 和（57.3±3.9）%，明顯高于對(duì)照組（18.5%±3.2%）（P＜0.05）。各組胃癌BGC-823細(xì)胞遷移情況見(jiàn)圖4。

圖4 各組胃癌BGC-823 細(xì)胞遷移情況Fig.4 Migration of BGC-823 cells in various groups

2.6 2組胃癌BGC-823細(xì)胞中VEGF、MMP-9、Bcl-2 和Bax蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，200 μg·L－1IL-17A組胃癌BGC-823 細(xì)胞中VEGF、MMP-9 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5 和表3。

表3 2組胃癌BGC-823 細(xì)胞中VEGF、MMP-9、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of VEGF,MMP-9,Bcl-2,and Bax proteins in gastric cancer BGC-823 cells in two groups(n=3，xˉ±s）

圖5 2組胃癌BGC-823 細(xì)胞中VEGF、MMP-9、Bcl2和Bax 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Eletrophoregram of expressions of VEGF,MMP-9, Bcl-2, and Bax proteins in gastric cancer BGC-823 cells in two groups

3 討 論

慢性炎癥是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。研究［10-12］顯示： 由CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生促炎性因子IL-17，參與多種慢性炎癥，通過(guò)與靶細(xì)胞膜表面受體IL-17R 結(jié)合，可激活下游通路，實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)效應(yīng)。IL-17A 及其受體IL-17RA 在炎癥、免疫性疾病和腫瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)受到廣大科研工作者的關(guān)注。然而，IL-17A 在胃癌中作用的相關(guān)報(bào)道較少。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IL-17A 及其受體IL-17RA在胃癌組織中的表達(dá)，并將重組人IL-17A 作用于胃癌BGC-823 細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制。

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多重因素介導(dǎo)的復(fù)雜過(guò)程，其中炎癥因子可以通過(guò)不同途徑影響腫瘤的發(fā)展和預(yù)后［13］。本研究結(jié)果顯示： 與正常胃組織比較，IL-17A 及其受體IL-17RA在胃癌組織中表達(dá)明顯增加，初步提示IL-17A 及其受體IL-17RA 可能參與了胃癌發(fā)展的進(jìn)程。研究［14-18］顯示：在前列腺癌組織中IL-17A 和IL-17RA mRNA表達(dá)水平升高；在結(jié)直腸癌和肝癌組織中，IL-17A 表達(dá)水平升高且患者預(yù)后不良；類似的結(jié)果也在鼻咽癌和宮頸癌相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，與本研究結(jié)果一致。因此一定條件下IL-17A 可以促進(jìn)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。吳振華［19］研究顯示：IL-17A 及其受體IL-17RA 可于體外促進(jìn)非小細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力；楊學(xué)良等［20］研究顯示：IL-17A 通過(guò)調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）和磷酸化STAT3（ phosphorylated STAT3 ，p-STAT3）影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；肖梓屾等［21］研究顯示：IL-17A 可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移?？梢?jiàn)IL-17A在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮作用。

本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：IL-17A作用于BGC-823 細(xì)胞后，IL-17A組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯降低。Bax 和Bcl-2 是一對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子［22］。本 研究 中Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：IL-17A 蛋白作用于BGC-823 細(xì)胞后，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平明顯升高，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)水平明顯降低，提示IL-17A 可能是通過(guò)線粒體調(diào)控Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示： IL-17A 作用于胃癌BGC-823 細(xì)胞后，細(xì)胞中VEGF 和MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高。VEGF 作為血管生成的主要調(diào)節(jié)因子之 一，研究［22-23］顯示：VEGF可以利用信號(hào)傳導(dǎo)刺激癌細(xì)胞增殖；且VEGF 與胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移存在明顯正相關(guān)關(guān)系。MMP-9 水平異常升高在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，研究［24］顯示：MMP-9 在胃癌組織中高表達(dá)，并且促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可見(jiàn)IL-17A 在一定程度上是通過(guò)調(diào)控VEGF 和MMP-9 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及遷移。

綜上所述，IL-17A 及其受體IL-17RA 可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程；重組IL-17A 可能通過(guò)激活Bcl-2 和Bax 信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的凋亡；同時(shí)，通過(guò)調(diào)控VEGF 和MMP-9 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，進(jìn)而影響胃癌的進(jìn)展。