基于HMMR 在肺腺癌組織中表達(dá)水平及其對LUAD 患者預(yù)后影響的生物信息學(xué)分析

李書珍, 曹雅杰, 耿海營, 蔡曾曉瑞,代春美, 溫有鋒, 李 寧,

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000；4.遼寧省人類表型組學(xué)重點研究實驗室，遼寧 錦州 121000）

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細(xì)胞肺癌最常見的組織學(xué)亞型，具有高度惡性和侵襲性，死亡率高，預(yù)后很差，缺乏有效的預(yù)后標(biāo)志物［1-2］。透明質(zhì)酸介導(dǎo)的細(xì)胞游走受體（hyaluronan-mediated motility receptor，HMMR）是一種進(jìn)化上保守的有絲分裂和減數(shù)分裂調(diào)節(jié)因子［3］。研究［4-5］顯示：HMMR參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、腫瘤發(fā)生、傷口愈合和炎癥等多種表型，特別是HMMR 與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。HCG18/miR-34a-5p/HMMR 調(diào)控軸加速了LUAD 疾病的進(jìn)展，沉默HMMR 能夠抑制肺癌A549 細(xì)胞的G2/M期轉(zhuǎn)換、增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［6-7］。HMMR 表達(dá)是大細(xì)胞肺癌患者生存有價值的預(yù)測指標(biāo)［8］。然而，HMMR 表達(dá)對LUAD 患者預(yù)后的影響以及其與患者各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性報道較少，其在LUAD 中的臨床價值和意義尚未完全闡明。本研究采用生物信息學(xué)方法，整合多個數(shù)據(jù)庫，探討HMMR 在LUAD組織中的表達(dá)，并闡明HMMR mRNA 表達(dá)水平與LUAD 患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。初步探討HMMR 高表達(dá)在LUAD組織中可能影響的通路及其表達(dá)與TP53 基因突變狀態(tài)的關(guān)系，為HMMR 在LUAD組織中功能和機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基因表達(dá)匯編（Gene Expression Ommibus，GEO）數(shù)據(jù)庫分析GEO是高通量微陣列和二代測序數(shù)據(jù)集的國際公共儲存數(shù)據(jù)庫，收錄了大量腫瘤和非腫瘤樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)集［9］。本文作者從GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下 載GSE6044 和GSE118370 基因芯片的Raw數(shù)據(jù)。采用R包affyPLM 對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸計算并繪制相對對數(shù)表達(dá)（relative log expression，RLE）箱線圖。GSE6044 包含5個正常肺組織和10個LUAD組織；GSE118370包含6個癌旁肺組織和6個LUAD組織。采用RMA 法校正Raw 數(shù)據(jù)并輸出到表格，多個探針對應(yīng)1個基因時取平均值，采用k-Nearest Neighbor 法尋找和填充缺失值，最終整理為基因表達(dá)矩陣。采用t檢驗評估HMMR在LUAD組織和正常肺組織中的表達(dá)差異。

1.2 腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫分析TCGA數(shù)據(jù)庫是迄今為止世界上最大的癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫，包含了基因組序列、表達(dá)、甲基化和拷貝數(shù)變異等多種類型數(shù) 據(jù)［10］。本文作者從TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//cancergenome.nih.gov/）下載LUAD mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)（HTSeq-FPKM）和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，共59個正常肺組織樣本和535個LUAD組織樣本。采用Perl 語言將表達(dá)數(shù)據(jù)整理為基因表達(dá)矩陣并采用limma R 包標(biāo)準(zhǔn)化，然后提取患者的生存狀態(tài)、年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期和M分期等臨床信息。刪除臨床信息不完整的樣本，其余337個LUAD組織樣本用于后續(xù)分析。采用Wilcoxon signed rank檢驗分析HMMR 在LUAD組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。Wilcoxon 檢驗分析HMMR 在不同臨床病理參數(shù)患者中的表達(dá)差異。通過邏輯回歸的方法探討HMMR mRNA 表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。采用survivalR包進(jìn)行單因素和多因素Cox分析，評估患者年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期、M分期與LUAD 患者預(yù)后的關(guān)系［11-13］。將單因素分析中結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入多因素Cox 回歸分析。為探討HMMR 異常表達(dá)所涉及的通路，本研究進(jìn)行了GSEA 富集分析。根據(jù)HMMR 表達(dá)量的中位值將癌癥樣本分為高表達(dá)顯型和低表達(dá)顯型。基因表達(dá)矩陣和表型文件作為輸入文件，c2cp.kegg.v7.2.symbols.gmt 作為參考基因集，采用gsea-3.0.jar 軟件進(jìn)行GSEA 富集分析。

1.3 人類蛋白圖譜（Human Protein Atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫和GEPIA2 數(shù)據(jù)庫采用HPA（http：//v13.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫探討HMMR 蛋白在LUAD組織和正常肺組織中的表達(dá)水平。在HPA 數(shù)據(jù)庫中，以“HMMR” 為檢索詞，選擇 “l(fā)ung”，選擇抗體（HPA043926），分析HMMR 蛋白在正常肺組織（患者ID： 2417）和LUAD組織（患者ID：1847）中的表達(dá)水平。通過GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫分析HMMR 表達(dá)對LUAD 患者總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（diseasefree survival，DFS）的影響［14］。在GEPIA2 主 界面搜索框內(nèi)輸入基因“HMMR”，選擇 “Survival Analysis”模塊，腫瘤類型設(shè)置為“LUAD”，Group Cutoff設(shè)置為“Median”，下載“Overall survival”和“Disease Free Survival”結(jié)果。

1.4 UALCAN和STRNG數(shù)據(jù)庫采 用UALCAN［15］（http：//ualcan.path.uab.edu/）數(shù)據(jù)庫探討LUAD組織中HMMR mRNA表達(dá)與TP53基因突變的關(guān)系。為了進(jìn)一步探討HMMR與p53 通路中蛋白的可能作用關(guān)系，從PathCards（https：//pathcards.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫下載p53通路中126個基因。打開STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）主頁，選擇“Multiple proteins” 和“Homo sapiens”，在“l(fā)ist of Names”輸入框輸入HMMR和上述126個基因，然后預(yù)測并可視化相應(yīng)蛋白間的相互作用。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析本研究中GEO 和TCGA數(shù)據(jù)庫的原始數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism軟件（version 8.0.1）和R 軟件（version 3.6.1）分析。GSE6044和GSE118370 芯片中HMMR 的表達(dá)水平符合正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗；TCGA 數(shù)據(jù)庫中，LUAD組織樣本中HMMR 表達(dá)水平分布不符合正態(tài)分布，采用Wilcoxon Signed Rank 檢驗（兩組間比較）或Kruskal-Wallis 檢 驗（多組間比較）。HMMR 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用邏輯回歸分析。采用單因素和多因素Cox分析評估HMMR 是否可以作為LUAD 的獨立預(yù)后因子。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LUAD組織和正常肺組織中HMMR mRNA和蛋白表達(dá)水平箱線圖結(jié)果顯示：每個樣本的RLE 中位值處于同一基線并位于 “0” 附近，說明芯片質(zhì)量合格，可以用于后續(xù)分析，見圖1。GEO數(shù)據(jù)庫結(jié)果分析結(jié)果顯示：LUAD組織中HMMR mRNA 表達(dá)水平高于正常組織（GSE6044，P＜0.01；GSE118370，P＜0.05），見圖2。在TCGA數(shù)據(jù)庫LUAD組織中HMMR mRNA 表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：在LUAD組織中HMMR 表達(dá)呈陽性，染色程度為 “低”，正常肺組織中未檢測到HMMR，呈陰性，見圖3。表明HMMR 在LUAD組織中的表達(dá)水平高于正常肺組織。

圖1 基因芯片GSE6044(A)和GSE118370(B)的相對對數(shù)表達(dá)箱線圖Fig.1 Box diagrams of relative log expression of GSE6044(A) and GSE118370(B)

圖2 正常組織和LUAD組織中HMMR mRNA 表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of HMMR mRNA in normal tissue and LUAD tissue

圖3 免疫組織化學(xué)法檢測正常肺組織和LUAD組織中HMMR 蛋白表達(dá)(Bar=100 μm)Fig.3 Expressions of HMMR protein in normal lung tissue and LUAD tissue detected by immunohistochemistry(Bar=100 μm)

2.2 HMMR 的生存分析和臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析GEPIA2 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明： HMMR mRNA 表達(dá)水平高的LUAD 患者OS（P＜0.01，見 圖4A）和DFS 較 短（P＜0.01，見 圖4B）。Wilcoxon 檢驗和Kruskal-Wallis 檢驗分析結(jié)果表明：HMMR mRNA 表達(dá)分別在不同的T分期（T1、T2、T3 和T4）、N分 期（YesvsNo）、M分 期（M0vsM1）、TNM分 期（stage Ⅰ、stage Ⅱ、stage Ⅲ和stageⅣ）和性別（FemalevsMale）患者中比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。邏輯回歸分析結(jié)果顯示： HMMR mRNA 表達(dá)與T分期、N分期和TNM分期有關(guān)（P＜0.05），見表1。

圖5 TCGA 數(shù)據(jù)庫中HMMR 表達(dá)與LUAD 患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Fig.5 Correlations between expression of HMMR and clinicopathological parameters of LUAD patients in TCGA database

表1 HMMR 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.1 Correlations between expression of HMMR and clinicopathological parameters of patients

圖4 GEPIA2 數(shù)據(jù)庫中HMMR 表達(dá)與LUAD 患者生存時間的關(guān)系Fig.4 Relationship between expression of HMMR and survival time of LUAD patients in GEPIA2 database

2.3 獨立預(yù)后分析單因素Cox分析結(jié)果表明：T分期、N分期、TNM分期和HMMR mRNA表達(dá)均與LUAD 患者預(yù)后有關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。多因素Cox分析結(jié)果表明： TNM分期和HMMR mRNA 的表達(dá)與LUAD 患者的預(yù)后有關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。見表2。

表2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中LUAD 患者的OS 與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Associations between OS and clinicopathologic parameters of LUAD patients in TCGA datatbase

2.4 HMMR 高表達(dá)富集的通路GSEA 富集分析結(jié)果顯示：在LUAD組織中高表達(dá)的HMMR 顯著富集在細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、同源重組、p53 信號通路、膀胱癌、小細(xì)胞肺癌和泛素化介導(dǎo)的蛋白水解等通路［NominalP＜0.05，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05］。見圖6。

圖6 HMMR 的基因集富集分析Fig.6 Gene set enrichment analysis on HMMR

2.5 HMMR 與p53 通路GSEA 富集分析結(jié)果顯示： 在LUAD 中p53 通路顯著富集在HMMRmRNA 高表達(dá)顯型。采用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析HMMR mRNA 表達(dá)與TP53 基因的突變相關(guān)性結(jié)果顯示：在肺腺癌組織中，HMMR mRNA 表達(dá)與TP53 突變相關(guān)（P＜0.01），見圖7A。STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：這些蛋白質(zhì)之間可能存在密切的調(diào)控作用，見圖7B。

圖7 HMMR 和p53信號通路的關(guān)系Fig.7 Relationship of HMMR and p53 signaling pathways

3 討 論

HMMR最初是作為透明質(zhì)酸受體被發(fā)現(xiàn)的，后來其對細(xì)胞周期的調(diào)控功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，HMMR可增強(qiáng)Polo樣激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）和Aurora-A 激酶（Auroka kinase A）等激酶活性，調(diào)節(jié)紡錘體的組裝和定位［3，16-17］。HMMR 蛋白可分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，細(xì)胞膜上的HMMR 蛋白與其受體CD44 結(jié)合，激活下游的ERK1/2，并與之結(jié)合形成復(fù)合體，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和運(yùn)動［17-18］。在細(xì)胞胞質(zhì)中，其N 端結(jié)構(gòu)域可以直接與微管結(jié)合，調(diào)控紡錘體的正確定位，磷酸化后出現(xiàn)核定位，并可能有助于TPX2蛋白的核運(yùn)輸［19］。研究［4，16，20］顯示：HMMR 在傷口愈合和神經(jīng)發(fā)育中起重要作用，可以維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性和致瘤性。HMMR 在多種癌癥患者中表達(dá)上調(diào)，如乳腺癌［21］、急慢性髓系白血?。?2］、胃癌、胰腺癌［24］、肝癌［25］和非小細(xì)胞肺癌［26］等，并與疾病進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)聯(lián)。研究［27］顯示：在新生兒細(xì)支氣管上皮細(xì)胞中，HMMR 表達(dá)與肺空氣含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Hyaluronan-CD44-HMMR 信號軸在肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和生存［6，28］。

本研究采用生物信息學(xué)的方法，探討了HMMR 在LUAD組織中的表達(dá)及其臨床意義。本研究結(jié)果表明：在LUAD組織中HMMR mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常肺組織和癌旁組織，并且mRNA 表達(dá)水平高的LUAD患者OS和DFS 較短，說明HMMR 在LUAD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用?；貧w分析結(jié)果表明：HMMR mRNA 表達(dá)與LUAD 患者的TNM分期、T分期和N分期有關(guān)聯(lián)。單因素分析結(jié)果表明：TNM分期、T分期、N分期和HMMR mRNA 表達(dá)水平與LUAD 患者的預(yù)后有關(guān)聯(lián)；多因素分析結(jié)果表明：具有較高HMMR mRNA表達(dá)的患者預(yù)后更差，且可以作為獨立的預(yù)后指標(biāo)評估LUAD 患者的預(yù)后。有研究［29］顯示：HMMR 是乳頭肌浸潤性膀胱癌的獨立預(yù)后指標(biāo)并與預(yù)后不良有關(guān)，這與本研究結(jié)論一致。為了探討LUAD組織中HMMR 高表達(dá)可能影響的通路，本文作者進(jìn)行GSEA 富集分析的結(jié)果顯示：細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、同源重組、p53信號通路、膀胱癌、胰腺癌、小細(xì)胞肺癌和泛素化介導(dǎo)的蛋白水解等通路顯著富集在HMMR 高表達(dá)顯型。這說明異常表達(dá)的HMMR 或許通過上述通路影響LUAD 的進(jìn)展。本文作者采用UALCAN 數(shù)據(jù)庫探討了HMMR mRNA 表達(dá)和TP53基因突變的關(guān)系［15］。本研究結(jié)果顯示：HMMR 的表達(dá)與TP53突變狀態(tài)有關(guān)聯(lián)。與非突變的肺腺癌患者比較，TP53 突變的患者HMMR mRNA 表達(dá)水平更高。本文作者采用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測了HMMR 和p53 信號通路中蛋白的可能相互關(guān)系，結(jié)果表明：HMMR 與BRCA1、CHEK1、MAPK1、CSNK1 D、TP53、CSNK1A1 和TNFRSF10B 之間可能有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。這些相互作用影響LUAD 發(fā)展的機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本研究采用生物信息學(xué)的方法，整合多個數(shù)據(jù)庫，證明了HMMR 在LUAD組織中呈高表達(dá)，闡明了HMMR 表達(dá)與LUAD患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，HMMR mRNA 高表達(dá)是LUAD 患者的獨立預(yù)后指標(biāo)，本研究結(jié)果為HMMR 在LUAD中的機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。