miR-490-3p 過表達對大鼠非酒精性脂肪性肝病的改善作用及其機制

龔 杰, 雷澤華, 張遠威, 黃 雄, 杜 波, 王志旭

（1.四川省樂山市人民醫(yī)院肝膽胰外科 四川省樂山市肝膽胰系統(tǒng)疾病診療中心，四川 樂山 614000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州 遵義 563000；3.四川省成都市第六人民醫(yī)院普外科，四川 成都 610051）

目前，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為全球性公共衛(wèi)生問題，預(yù)計到2030年NAFLD 將成為肝臟移植的主要原因［1］。盡管NAFLD 的發(fā)病機制尚未完全闡明，但 “二次打擊” 理論詮釋NAFLD 已得到廣泛認可，該理論主要認為脂質(zhì)沉積于肝細胞，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激等一系列細胞毒性事件，導(dǎo)致肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)［2］。臨 床 研究［3］顯示： 早 期NAFLD 及時干預(yù)可能逆轉(zhuǎn)病情，若患者未得到及時治療，病情會進展為脂肪性肝炎和肝硬化，甚至肝癌。現(xiàn)階段NAFLD 的治療除飲食控制和加強運動外，尚缺乏療效確切的治療藥物［4］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類具有重要生物學(xué)功能的非編碼小RNA，相關(guān)研究［5-6］顯示：NAFLD患者體內(nèi)多種miRNA 表達出現(xiàn)異常，且miRNA 可靶向下游基因表達，調(diào)控脂質(zhì)代謝，參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。ZHU 等［7］研究顯示：NAFLD 患 者中miR-490-3p 表達下調(diào)，可作為NAFLD 的潛在生物標記物，但miR-490-3p 在NAFLD 中具體的作用機制尚不清楚。本研究觀察miR-490-3p 過表達對大鼠NAFLD 的改善作用，并初步分析其作用機制，以期為NAFLD 的臨床診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器32只SD 大鼠，雄性，SPF級別，6～8周齡，體質(zhì)量200～240 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-0004。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫21℃～25℃，相對濕度為40%～60%，明暗交替周期為12 h，給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。普通飼料和高脂飼料（北京奧博星生物科技有限公司），含無意義序列或miR-490-3p mimic 質(zhì)粒的腺病毒（上海吉滿生物科技有限公司），總RNA 提取試劑盒（美國Beyotime 公司），丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、丙二 醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔多克隆抗Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、核因子κB（nuclear factor- κ B，NF- κB）和磷酸化NF-κB（phosphorylated NF-κB）抗體（美國Abcam 公司），引物序列由德國Qiagen公司合成并提供。CFX96 型實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美國Bio-Rad 公司），7020 型全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 NAFLD 模型的制備32只SD 大鼠隨機分為對照組、模型組、陰性對照組（mimic-NC組）和miR-490-3p 模擬物組（miR-490-3p mimic組），每組8只。除對照組外，其他各組大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)12周，自由攝食飲水，對照組大鼠以普通飼料喂養(yǎng)。12周時，除對照組外，每組隨機逃選1只大鼠處死，剖取肝組織行HE 染色，驗證NAFLD 模型是否構(gòu)建成功。mimic-NC組和miR-490-3p mimic組大鼠分別尾靜脈注射含無意義序列和miR-490-3p mimic 質(zhì)粒的腺病毒，對照組和模型組大鼠不作任何處理，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，采用RT-qPCR 法檢測各組大鼠肝組織中miR-490-3p 表達水平。

1.3 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)取大鼠肝組織固定于4% 多聚甲醛溶液中，制備肝組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化后，行常規(guī)HE 染色和油紅O 染色，觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 各組大鼠血清肝功能指標檢測采集大鼠腹主動脈血，3 000 r·min－1離心15 min，取上層血清，經(jīng)全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清ALT和AST 水平。

1.5 各組大鼠血清炎癥因子和氧化應(yīng)激指標檢測取各組大鼠腹主動脈血的血清，參照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 和MDA 水平及SOD 和GSH-Px 活性。

1.6 RT-qPCR 法檢測各組大鼠肝組織中miR-490-3p、TLR4 mRNA 和NF-κB mRNA 表達水平取大鼠肝臟組織，加入液氮研磨，添加總RNA 提取試劑盒提取組織中總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 鏈，采用RT-qPCR儀擴增，參數(shù)設(shè)置為94℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)38次。引物序列：miR-490-3p 上 游引 物5′-CGCAACCTGGAGGACTCC-3′，下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；TLR4上游引物5′-GCGCTCGAGGGAGTACAAAACTCTGCGCC-3′ ，下游引物5′-AATGCGGCCGCAGTTTATAGTCAAGGCAAGG-3′；NFκB 上游引物5′-CAAGCGAGGAGGGGACGTG-3′ ，下游引物5′-CCCCCAGAGCCTCCACCC-3′。以β -actin 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算各組大鼠 肝組織中miR-490-3p、TLR4 mRNA 和NF-κB mRNA表達水平。

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB 蛋白表達水平取大鼠肝臟組織，加入液氮研磨，添加蛋白裂解液提取總蛋白并定量，經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，采用5% 脫脂奶粉封閉1 h（室溫），置于一抗液（1∶1 000）孵育過夜（4℃），次日添加二抗（1∶5 000）孵育1 h（室溫），最后采用ECL發(fā)光試劑進行曝光顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參，計算各組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB 蛋白表達水平。目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠肝組織中miR-490-3p 表達水平，血清ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β 和MDA 水 平 及SOD 和GSH-Px活性，肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA 表達水平，TLR4 和NF-κB蛋白表達水平服從正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝組織中miR-490-3p 表達水平對照組、模型組、mimic-NC組和miR-490-3p mimic組大鼠肝組織中miR-490-3p 表達水平分別為3.19±0.32、1.14±0.18、1.22±0.21 及2.75±0.26。與對照組比較，模型組大鼠肝組織中miR-490-3p 表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，miR-490-3p mimic組大鼠肝組織中miR-490-3p表達水平升高（P＜0.05）；但模型組和mimic-NC組大鼠肝組織中miR-490-3p 表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明miR-490-3p mimic 轉(zhuǎn)染成功。

2.2 HE 染色觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠肝細胞排列均勻，細胞中未見脂肪堆積，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組和mimic-NC組大鼠肝細胞內(nèi)堆積大量脂肪，門管區(qū)伴有明顯炎性細胞浸潤，部分肝細胞呈壞死并出現(xiàn)纖維化病變；miR-490-3p mimic組大鼠肝組織病變程度較模型組減輕，但肝小葉內(nèi)仍可見炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.1 Morphology of liver tissue of rats in various groups(HE,×400）

2.3 油紅O 染色觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組大鼠肝組織中未見明顯紅染脂肪滴；模型組和mimic-NC組大鼠肝組織中可見明顯紅染的脂肪滴，數(shù)量多且體積大；miR-490-3p mimic組大鼠肝組織中脂肪滴體積和數(shù)量均明顯減少。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織病理形態(tài)表現(xiàn)（油紅O，×400）Fig.2 Morphology of liver tissue of rats in various groups(Oil red O,×400）

2.4 各組大鼠血清ALT 和AST 水平與對照組比較，模型組大鼠血清ALT 和AST 水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-490-3p mimic組大鼠血清ALT 和AST 水平均降低（P＜0.05）；但模型組和mimic-NC組大鼠血清ALT 和AST 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT 和AST 水平Tab.1 Levels of serum ALT and AST of rats in various groups [n=7，±s,λB/(IU·L-1)]

表1 各組大鼠血清ALT 和AST 水平Tab.1 Levels of serum ALT and AST of rats in various groups [n=7，±s,λB/(IU·L-1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model mimic-NC miR-490-3p mimic ALT 36.94±2.71 102.88±17.76*99.14±10.77 44.26±3.37△AST 89.17±5.38 171.36±15.33*167.53±12.61 106.09±7.67△

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平與對照組 比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-490-3p mimic組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均降低（P＜0.05）；模型組和mimic-NC組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平Tab.2 Levels of serum inflammatory factors of rats in various groups [n=7，±s,ρB/(μg·L-1)]

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平Tab.2 Levels of serum inflammatory factors of rats in various groups [n=7，±s,ρB/(μg·L-1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model mimic-NC miR-490-3p mimic TNF-α 40.02±11.34 76.80±9.69*72.90±10.30 45.29±15.06△IL-6 36.59±4.47 120.15±12.09*116.59±9.66 51.56±6.41△IL-1β 15.81±2.34 29.73±4.23*27.39±3.43 20.95±1.49△

2.6 各組大鼠血清MDA 水平、SOD 和GSH-Px 活性與對照組比較，模型組大鼠血清MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 和GSH-Px 活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，miR-490-3p mimic組大鼠血清SOD 和GSH-Px 活性升高（P＜0.05），MDA水平降低（P＜0.05）；但模型組和mimic-NC組大鼠血清MDA 水平和SOD 及GSH-Px 活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清MDA 水平及SOD 和GSH-Px 活性Tab.3 Levels of serum MDA and activities of SOD and GSH-Px of rats in various groups（n=7，±s）

表3 各組大鼠血清MDA 水平及SOD 和GSH-Px 活性Tab.3 Levels of serum MDA and activities of SOD and GSH-Px of rats in various groups（n=7，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model mimic-NC miR-490-3p mimic MDA[mB/（μmol·g－1）]5.07±0.54 10.80±1.17*10.21±0.78 6.29±0.46△SOD[λB/（U·mg－1）]151.79±10.18 80.12±6.43*85.65±5.86 107.16±5.66△GSH-Px[λB/（U·mg－1）]648.49±73.46 403.14±46.89*428.61±55.39 605.62±62.55△

2.7 各組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，miR-490-3p mimic組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平降低（P＜0.05）；但模型組和mimic-NC組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3和表4。

表4 各組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA and proteins in liver tissue of rats in various groups（n=7，±s）

表4 各組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB mRNA 及蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA and proteins in liver tissue of rats in various groups（n=7，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group.

Group Control Model mimic-NC miR-490-3p mimic TLR4 mRNA 0.83±0.14 3.58±0.29*3.46±0.25 2.24±0.22△Protein 0.11±0.02 0.94±0.06*0.89±0.05 0.39±0.03△NF-κB mRNA 0.64±0.17 4.21±0.34*4.18±0.39 2.76±0.26△Protein 0.38±0.09 0.74 ±0.69*0.69±0.12 0.51 ±0.14△

圖3 各組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of TLR4 and NF-κB proteins in liver tissue of rats in various groups

3 討 論

隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，靶向藥物的研發(fā)取得了突破性進展。miRNA 在多種生理病理性疾病中起重要的調(diào)控作用，當(dāng)miRNA 表達上調(diào)或下調(diào)時，其對靶點蛋白合成的抑制作用增強或減弱，導(dǎo)致靶點蛋白的合成減少或增加，從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展［8-9］。若靶點蛋白恰好又參與肝臟脂肪代謝和轉(zhuǎn)運，則會引起肝臟脂肪代謝和轉(zhuǎn)運障礙，進而導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生［10］。miR-490-3p 位于第17 號染色體，其在哺乳動物中具有高度的保守性，OU等［11］研究顯示：miR-490-3p可靶向ATG7抑制肝癌細胞增殖和自噬，延緩細胞周期，并促進其凋亡。WANG 等［12］研究顯示：miR-490-3p 在結(jié)直腸癌組織樣本中呈異常低表達，其表達水平與患者臨床病理特征密切相關(guān)；進一步進行體外實驗結(jié)果顯示： miR-490-3p 過表達可靶向RAB14，抑制細胞增殖、集落形成和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡。上述研究結(jié)果表明：miR-490-3p 在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌因子的作用，但miR-490-3p是否還有其他生物學(xué)功能尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示：肝細胞中堆積了大量脂肪，門管區(qū)伴有炎性細胞浸潤，部分肝細胞壞死，且部分表現(xiàn)出纖維化病變，提示NAFLD 大鼠模型構(gòu)建成 功［13］。為觀察miR-490-3p過表達對NAFLD的影響，經(jīng)尾靜脈注射miR-490-3p mimic腺病毒載體后，大鼠肝組織中miR-490-3p表達水平明顯升高，表明miR-490-3p 過表達成功。通過進一步比較發(fā)現(xiàn)：miR-490-3p mimic組大鼠肝組織病變程度較模型組減輕，血清ALT和AST水平降低，提示miR-490-3p 過表達可明顯改善NAFLD，有利于肝功能的恢復(fù)。

目前，關(guān)于NAFLD 的發(fā)病機制尚未完全闡明，多認為其發(fā)病與遺傳、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗和肝臟脂代謝紊亂等有關(guān)［14-15］。YANG 等［16］研究顯示： miR-490-3p可通過抑制IRAK1/TRAF6 通路，明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷和炎癥反應(yīng)。本研究采用ELISA 法檢測大鼠血清炎癥因子和氧化應(yīng)激指標水平結(jié)果顯示：miR-490-3p 過表達后，血清TNF-α、IL-6、IL-1β和MDA 水平降低，抗氧化酶SOD 和GSH-Px 水平升高，表明miR-490-3p 過表達可降低NAFLD 大鼠炎癥反應(yīng)，緩解氧化應(yīng)激。TLR4 是Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族的重要成員，可介導(dǎo)機體固有免疫，通過TLR4/NF-κB 信號通路在NAFLD 中發(fā)揮作用［17-18］。無刺激信號時，NF-κB與其抑制物結(jié)合形成復(fù)合體形式，位于細胞質(zhì)中；當(dāng)細胞中脂肪過度堆積時，游離脂肪酸將激活TLR4，與髓樣分化因子88 結(jié)合活 化NF-κB 抑制物，使得NF-κB 從復(fù)合體上解離并轉(zhuǎn)移至細胞核，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終誘導(dǎo)級聯(lián)式炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟炎 癥 及纖維化［19］。LIU 等［20］研究顯示：濱蒿內(nèi)脂可有效改善NAFLD，這可能與阻斷TLR4/NF-κB 信號通路有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，miR-490-3p mimic組大鼠肝組織中TLR4 mRNA 和蛋白及NF-κB mRNA 表達水平均降低，提示miR-490-3p過表達可抑制TLR4/NF- κB 信號，這可能是miR-490-3p 過表達改善NAFLD 的潛在機制之一。

綜上所述，miR-490-3p 過表達可減輕NAFLD損傷，其機制可能是阻滯TLR4/NF-κB 信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激。本研究從基因水平揭示了miR-490-3p 與NAFLD 的關(guān)系，提示miR-490-3p 可作為NAFLD 治療的潛在治療靶點，但其具體作用機制仍需要深入分析。