鞘內(nèi)注射瞬時(shí)受體電位通道A1 shRNA 對(duì)部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎小鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用及其機(jī)制

趙 峰, 樊少卿, 程曉燕, 李小娜, 李長(zhǎng)生, 馬浩杰

（1.河南省中醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450002；2.河南省腫瘤醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450003）

神經(jīng)病理性疼痛是一種由損傷或疾病影響軀體感覺(jué)系統(tǒng)引起的慢性疼痛，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療效果不佳［1］。星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量存在，與突觸有密切聯(lián)系，并且產(chǎn)生趨化因子，參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展，星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在神經(jīng)性疼痛中發(fā)揮重要作用［2］。瞬時(shí)受體電位通道A1（transient receptor potential cation channel subfamily A member 1，TRPA1）是 瞬 時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道家族的一員。TRP 通道是一種非選擇性鈣離子（Ca2+）通透性陽(yáng)離子通道，通過(guò)介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+水平升高，引起神經(jīng)遞質(zhì)的釋放產(chǎn)生疼痛［3］。采用TRP 通道拮抗劑能減輕神經(jīng)病理性疼痛［4-5］。TRPA1 不僅參與調(diào)節(jié)炎癥性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏和炎性疾病，還參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生［6-7］。但目前關(guān)于TRPA1在部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎（partial sciatic nerve ligation，pSNL）小鼠神經(jīng)性疼痛模型中的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究觀察TRPA1 在pSNL 小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的作用，探討TRPA1 是否可以通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，以及其發(fā)揮作用的具體機(jī)制，為研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器30只SPF級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK（川）2019-189。RIPA 蛋白裂解液和PMSF 蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司），兔抗TRPA1 抗體（1∶1 000，美國(guó)Proteintech 公司），兔抗蛋白激酶C ε 型（protein kinase C epsilon type，Prkce）抗體（1∶1 000）、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1∶5 000）、兔抗GAPDH 抗體（1∶5 000）和山羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000，英國(guó)Abcam 公司）。動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀和智能熱板儀（天津伯爾尼科技有限公司），Multiskan FC 酶標(biāo)儀和－80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），美國(guó)伯樂(lè)蛋白電泳儀和蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.2 小鼠pSNL 模型的建立和分組30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）、假手術(shù)組（6只）和pSNL組（18只）。pSNL組小鼠經(jīng)4% 水合氯醛腹腔注射麻醉后，于左側(cè)股骨后外側(cè)作一切口，分離并暴露坐骨神經(jīng)主干，采用8-0 絲線結(jié)扎1/3～1/2 的坐骨神經(jīng)直徑厚度。假手術(shù)組小鼠切開(kāi)皮膚肌肉找到神經(jīng)后不結(jié)扎直接縫合切口，對(duì)照組小鼠不進(jìn)行任何處理，小鼠麻醉清醒后自由進(jìn)食飲水。為觀察TRPA1 對(duì)pSNL 所致神經(jīng)病理性疼痛的影響，pSNL組小鼠鞘內(nèi)置管成功后隨機(jī)分為pSNL模型組、pSNL+NC短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）組 和pSNL+TRPA1 shRNA組，每組60只。pSNL+TRPA1 shRNA組小鼠于術(shù)后第7天鞘內(nèi)注射TRPA1 shRNA。TRPA1 shRNA 由河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.3 各組小鼠行為學(xué)觀察于注射前和注射后l、7、12 及24h檢測(cè)各組小鼠術(shù)側(cè)后肢的機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）和熱閾值（thermal withdrawal latency，TWL）。采用動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀測(cè)量各組小鼠的MWT，打開(kāi)電源，將最大強(qiáng)度設(shè)置為50 g，然后將小鼠置于塑料網(wǎng)格中自由活動(dòng)。小鼠安靜下來(lái)后，將探針對(duì)準(zhǔn)左肢的足底中央，逐漸增加力度，當(dāng)小鼠出現(xiàn)縮足現(xiàn)象時(shí)，記錄數(shù)值，即為MWT。采用智能熱板儀測(cè)定TWL，打開(kāi)熱板儀，將溫度設(shè)置為（52.0±0.2）℃，然后將小鼠放入，記錄小鼠有明顯抽搐欲逃離所需的時(shí)間，即為TWL。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞的分離培養(yǎng)和處理人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK）-293T 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于含5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。從pSNL組小鼠中分離培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染TRPA1、Prkce 腺病毒表達(dá)載體和shRNA，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。TRPA1、Prkce 腺病毒表達(dá)載體和shRNA 由河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.5 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）中TRPA1、Prkce和GFAP 蛋白表達(dá)水平采用胰酶消化各組小鼠術(shù)側(cè)DRG，加入RIPA 裂解液于冰上裂解20 min，低溫高速離心30 min 收集上清，即裂解的蛋白樣品。經(jīng)BCA 法檢測(cè)蛋白濃度后，將蛋白樣品加相應(yīng)體積的4×loading buffer 煮沸使蛋白變性。等量蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將目標(biāo)蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃過(guò)夜孵育相應(yīng)的一抗。次日，TBST 漂洗后，室溫孵育HRP 標(biāo)記的二抗1 h，漂洗后采用ECL 發(fā)光液檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平。采用ECL 液顯影，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中檢測(cè)，采用Image-ProPlus 6 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 各組細(xì)胞中TRPA1 和GFAP 蛋白的表達(dá)及血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）水平分離培養(yǎng)pSNL組小鼠的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染TRPA1 腺病毒表達(dá)載體或shRNA繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分為空質(zhì)粒組、Ad-TRPA1、sh-NC組和sh-TRPA1組。采用Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRPA1 和GFAP 蛋白表達(dá)水平（方法見(jiàn) “1.5”）。動(dòng)物模型血液樣本經(jīng)離心收集血清后用于炎癥因子的檢測(cè)。按照TNF-α和MCP-1 ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）法驗(yàn)證TRPA1 和Prkce 的相互作用將HEK-293T 細(xì)胞接種于6 孔板，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染TRPA1 腺病毒表達(dá)載體和Prkce 腺病毒表達(dá)載體。48h后離心收集細(xì)胞，加入含PMSF 的細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min。裂解液與TRPA1 抗體孵育過(guò)的磁珠于4℃過(guò)夜孵育。次日，采用PBST洗滌磁珠后，加入洗脫液洗脫蛋白復(fù)合物，采用Western blotting 法檢測(cè)洗脫液中TRPA1 和Prkce蛋白的表達(dá)。操作過(guò)程中設(shè)置IgG 抗體孵育的磁珠作為對(duì)照以排除非特異性結(jié)合。

1.8 各組細(xì)胞中TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平為進(jìn)一步檢測(cè)TRPA1 及互作蛋白Prkce 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，將TRPA1 shRNA 單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與Ad-Prkce 共轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞分為sh-TRPA1+empty vector組（轉(zhuǎn)染空載體）和sh-TRPA1+Ad-Prkce組（轉(zhuǎn)染Prkce 過(guò)表達(dá)載體）。48h后采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRPA1、Prkce和GFAP 蛋白表達(dá)水平（方法見(jiàn) “1.5”），ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平（方法見(jiàn) “1.6”）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠MWT 和TWL，小鼠DRG組織中TRPA1 及GFAP 蛋白表達(dá)水平，小鼠血清和細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平，各組細(xì)胞中TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠MWT 和TWL小鼠部分行pSNL后第7天鞘內(nèi)注射TRPA1 shRNA，于注射前和注射后l、7、12 和24h檢測(cè)小鼠術(shù)側(cè)后肢MWT 和TWL 結(jié)果顯示： 與假手術(shù)組比較，pSNL組小鼠MWT 和TWL 降低（P＜0.01），表明模型構(gòu)建成功。與pSNL組比較，pSNL+ NC shRNA組小鼠MWT 和TWL 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而pSNL+TRPA1 shRNA組小鼠MWT 和TWL 明顯升高（P＜0.01）。見(jiàn)表1 和2。

表1 各組小鼠的MWTTab.1 MWT of mice in various groups (n=6，±s，g）

表1 各組小鼠的MWTTab.1 MWT of mice in various groups (n=6，±s，g）

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs pSNL group；#P＜0.05 vs pSNL+NC shRNA group.

Group Control Sham operation pSNL pSNL+NC shRNA pSNL+TRPA1 shRNA MWT Before injection 11.51±0.80 11.20±0.68 5.62±0.33*5.82±0.42*5.53±0.28*1hafter injection 11.70±0.21 11.82±0.25 5.53±0.25*5.73±0.33*9.31±0.13*△#7hafter injection 11.06±0.45 10.80±0.31 5.72±0.13*5.52±0.43*10.22±0.42△#12hafter injection 10.81±0.35 11.22±0.43 5.51±0.32**5.81±0.63**10.73±0.48△#24hafter injection 11.62±0.34 11.31±0.14 4.84±0.69*4.55±0.38*10.90±0.13△#

2.2 各組小鼠DRG 中TRPA1 和GFAP 蛋白表達(dá)水平及血清中TNF-α 和MCP-1 水平與假手術(shù)組比較，pSNL組小鼠術(shù)側(cè)DRG 中TRPA1 和GFAP蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），提示pSNL 后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活數(shù)增多。與pSNL+NC shRNA組比較，pSNL+TRPA1 shRNA組小鼠DRG 中GFAP蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1 和2。ELISA 法檢測(cè)炎癥因子分泌結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，pSNL組小鼠血清中TNF-α 和MCP-1 水平 升高（P＜0.05），與pSNL+NC shRNA組比較，pSNL+TRPA1 shRNA組小鼠血清中TNF-α和MCP-1 水平降低（P＜0.05），即敲低TRPA1 表達(dá)可減輕pSNL 小鼠神經(jīng)性疼痛的炎癥反應(yīng)，緩解因pSNL 引起的神經(jīng)性疼痛。見(jiàn)表3。

表3 ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.3 Levels of TNF- α and MCP-1 in serum of mice in various groups detected by ELISA method[n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

表3 ELISA 法檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.3 Levels of TNF- α and MCP-1 in serum of mice in various groups detected by ELISA method[n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs pSNL+NC shRNA group.

Group Sham operation pSNL pSNL+NC shRNA pSNL+TRPA1 shRNA TNF-α 65.50±4.63 239.54±8.35*248.49±3.28 85.56±4.38△MCP-1 49.35±2.68 156.18±4.38*152.47±7.33 43.64±6.23△

圖1 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠DRG 中TRPA1 和GFAP 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of TRPA1 and GFAP proteins in DRG of mice in various groups detected by Western blotting method

表2 各組小鼠的TWLTab.2 TWL of mice in various groups (n=6，±s，t/s）

表2 各組小鼠的TWLTab.2 TWL of mice in various groups (n=6，±s，t/s）

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs pSNL group；#P＜0.05 vs pSNL+NC shRNA group.

Group Control Sham operation pSNL pSNL+NC shRNA pSNL+TRPA1 shRNA TWL Before injection 18.52±0.90 18.20±0.76 11.04±0.22*10.81±0.32*10.50±0.18*1hafter injection 17.71±0.19 17.81±0.65 10.91±0.12*10.74±0.31*16.33±0.23*7hafter injection 17.20±0.25 17.80±0.11 10.33±0.35*10.40±0.53*16.52±0.51*△#12hafter injection 16.83±0.51 17.22±0.46 10.52±0.65*10.31±0.53*16.81±0.55△#24hafter injection 17.64±0.43 18.03±0.12 8.73±0.52*8.53±0.34*17.63±0.63△#

圖2 各組小鼠DRG中TRPA1和GFAP蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of TRPA1 and GFAP proteins in DRG of mice in various groups

2.3 各組細(xì)胞中TRPA1 和GFAP 蛋白表達(dá)和細(xì)胞上清中TNF-α 及MCP-1 水平與空質(zhì)粒組比較，Ad-TRPA1組細(xì)胞中TRP1 和GFAP蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與sh-NC組比較，sh-TRPA1組細(xì)胞中TRPA1 和GFAP 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3和4。與空質(zhì)粒組比較，Ad-TRPA1組細(xì)胞上清中TNF-α和MCP-1水平明顯升高（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-TRPA1組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平 明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.4 Levels of TNF-α and MCP-1 in cell supernatant in various groups detected by ELISA method[n=3,±s, ρB/(ng·L-1)]

表4 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.4 Levels of TNF-α and MCP-1 in cell supernatant in various groups detected by ELISA method[n=3,±s, ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 vs empty vector group；△P＜0.05 vs sh-NC group.

Group Empty vector Ad-TRPA1 sh-NC sh-TRPA1 TNF-α 77.34±4.38 210.42±5.36*75.23±8.37 28.53±4.39△MCP-1 43.59±4.82 148.26±7.85*53.65±2.34 13.48±2.33△

圖3 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRPA1 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of TRPA1 protein in cells in various groups detected by Western blotting method

2.4 各組細(xì)胞中Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞上清中TNF- α 和MCP-1 水 平采 用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染Prkce 腺病毒表達(dá)載體或shRNA 進(jìn)入原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)48 h，采用Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞中Prkce 和GFAP 蛋白的表達(dá)，收集細(xì)胞上清液檢測(cè)炎癥因子的分泌結(jié)果顯示：與空質(zhì)粒組比較，Ad-Prkce組細(xì)胞中GFAP蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），與sh-NC組比較，sh-Prkce組細(xì)胞中GFAP 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5 和6。與空質(zhì)粒組比較，Ad-Prkce組細(xì)胞上清 中TNF-α和MCP-1水平明顯升高（P＜0.01），與sh-NC組比較，sh-Prkce組細(xì)胞上清中TNF-α和MCP-1水平明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.5 Levels of TNF- α and MCP-1 in cell supernatant in various groups detected by ELISA method[n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

表5 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.5 Levels of TNF- α and MCP-1 in cell supernatant in various groups detected by ELISA method[n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.01 vs empty vector group；△P＜0.01 vs sh-NC group.

Group Empty vector Ad-Prkce sh-NC sh-Prkce TNF-α 80.21±3.46 240.25±5.62*75.23±8.39 25.38±4.92△MCP-1 45.91±6.29 179.65±8.53*42.78±6.47 12.81±5.38△

圖4 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中GFAP 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of GFAP protein in cells in various groups detected by Western blotting method

圖5 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of Prkce and GFAP proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 TRPA1 和Prkce 相互作用關(guān)系通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)STRING 預(yù)測(cè)TRPA1 和Prkce 相互作用關(guān)系見(jiàn)圖7。Co-IP 法進(jìn)一步驗(yàn)證其相互作用。見(jiàn)圖8。

圖7 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)TRPA1 和Prkce 的相互作用Fig.7 Interaction between TRPA1 and Prkce predicted by STRING database

圖8 Co-IP 法驗(yàn)證TRPA1 和Prkce 的相互作用Fig.8 Interaction between TRPA1 and Prkce verified by Co-IP method

2.6 各組細(xì)胞中TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平為進(jìn)一步檢測(cè)TRPA1 及互作蛋白Prkce對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，TRPA1 shRNA 單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與Ad-Prkce 共轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞。48h后檢測(cè)TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平，收集細(xì)胞上清檢測(cè)炎癥因子的分泌結(jié)果顯示： 與sh-TRPA1+empty vector組比較，sh-TRPA1+Ad-Prkce組細(xì)胞中TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖9和10。與sh-TRPA1+empty vector組比較，sh-TRPA1+Ad-Prkce組細(xì)胞上清中TNF- α 和MCP-1水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.6 Levels of TNF- α and MCP-1 in cell supernatant in various groups detected by ELISA method[n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

表6 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-α 和MCP-1 水平Tab.6 Levels of TNF- α and MCP-1 in cell supernatant in various groups detected by ELISA method[n=3,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P＜0.05 vs sh-NC group；△P＜0.05 vs sh-TRPA1+empty vector group.

Group sh-NC sh-TRPA1 sh-TRPA1+empty vector sh-TRPA1+Ad-Prkce TNF-α 90.55±5.68 29.13±4.29*25.33±6.22 85.16±7.15△MCP-1 46.98±7.38 15.58±5.62*14.81±6.72 43.75±6.36△

圖6 各組細(xì)胞中Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of Prkce and GFAP proteins in cells in various groups

圖9 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.9 Electrophoregram of expressions of TRPA1,Prkce, and GFAP proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

脊髓中的膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用［8-9］。周圍神經(jīng)損傷后脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，其激活可能與促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和TNF-α 的 產(chǎn) 生和釋放有關(guān)［10］。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)各種有害或生理刺激反應(yīng)迅速且敏感，當(dāng)機(jī)體受到某種刺激時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物GFAP 表達(dá)增加［11-13］。

圖10 各組細(xì)胞中TRPA1、Prkce 和GFAP 蛋白表達(dá)水平Fig.10 Expression levels of TRPA1, Prkce, and GFAP proteins in cells in various groups

研究［14-16］顯示：TRPA1在傷害性神經(jīng)信號(hào)傳遞中高表達(dá)，參與神經(jīng)病理性疼痛的形成，采用TRPA1 拮抗劑HC-030031 可減輕大鼠的炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛。芳樟醇?xì)馕逗桶仔g(shù)素可以通過(guò)TRPA1 通路對(duì)小鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［17-18］，與本課題組發(fā)現(xiàn)的pSNL 小鼠DRG 中TRPA1 蛋白表達(dá)升高以及MWT和TWL 降低結(jié)果一致。在pSNL 小鼠中，二甲基三硫醚作用于TRPA1 受體可減輕創(chuàng)傷性神經(jīng)性疼痛［19］。鞘內(nèi)注射miR-141-5p mimic可以通過(guò)下調(diào)TRPA1 的表達(dá)減弱奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng) 性疼痛［20］。但目前 關(guān) 于TRPA1 在pSNL 小鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中的作用機(jī)制并不明確，本研究結(jié)果顯示： 鞘內(nèi)注射TRPA1 shRNA組小鼠DRG中GFAP 蛋白表達(dá)水平降低，炎癥因子分泌減少，MWT 和TWL 升高，說(shuō)明敲低TRPA1 的表達(dá)可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)性疼痛。

本文作者分離培養(yǎng)pSNL 小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)：過(guò)表達(dá)TRPA1 促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎癥因子的分泌，敲低TRPA1 抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥因子的分泌。為進(jìn)一步研究TRPA1 在神經(jīng)性疼痛中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)與TRPA1 相互作用的蛋白Prkce，Prkce 是蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族成員之一［21］，其通過(guò)與細(xì)胞骨架相互作用參與調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程［22］，還可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等［23-24］。研究［25］顯示：Prkce 是一種信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用。大鼠DRG 持續(xù)受壓后，術(shù)側(cè)脊髓背角中Prkce 和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)記物GFAP蛋白表達(dá)上調(diào)，表明Prkce 可能通過(guò)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活參與大鼠DRG 持續(xù)受壓病理性神經(jīng)痛的中樞敏化機(jī)制。重組脂聯(lián)素通過(guò)抑制PKC 通路的激活抑制小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧模型中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)［26］。通過(guò)鞘內(nèi)注射阻斷TRPM8 通過(guò)抑制PKC 和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路減輕神經(jīng)痛大鼠DRG 的冷痛過(guò)敏［27］。研究［28］顯示：脊 髓神經(jīng)元一氧化氮合酶與突觸后致密物95 相互作用，通過(guò)激活Prkce，促進(jìn)坐骨神經(jīng)慢性收縮損傷小鼠神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展，這與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示：在pSNL 小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Prkce 促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎癥因子的分泌，敲低Prkce 抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及炎癥因子的分泌，且過(guò)表達(dá)Prkce 可以逆轉(zhuǎn)TRPA1 shRNA 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活以及炎癥因子分泌的抑制作用，即TRPA1 和Prkce 相互作用影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎癥因子的釋放，參與pSNL 小鼠神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，TRPA1 通過(guò)與Prkce 相互作用參與pSNL 模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)性疼痛的發(fā)生發(fā)展。