當(dāng)歸六黃湯對(duì)前列腺癌荷瘤小鼠的免疫功能調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制

胡培森, 崔洪泉, 趙俊峰, 吳志洲, 王交托

（河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）指發(fā)生于前列腺的上皮性惡性腫瘤，發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第6 位，年齡低于55歲的男性群體發(fā)病率較低，55歲后發(fā)病率逐漸升高，且隨年齡增長(zhǎng)而升高，70～80歲年齡段PCa發(fā)病率最高［1-2］。PCa 患者早期癥狀不明顯，隨著腫瘤的發(fā)展，患者表現(xiàn)出排尿困難、尿潴留和血尿等臨床癥狀［3-4］。目前臨床主要通過(guò)放療、內(nèi)分泌治療和手術(shù)等方式治療PCa，但無(wú)法根治且存在泌尿系統(tǒng)梗阻和癌轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥，因此，尋找有效治療方式對(duì)于改善預(yù)后和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間尤其重要。臨床研究［5］顯示：PCa患者免疫功能低下，并與病理分化程度和臨床分期有關(guān)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［6］證實(shí)：PCa 細(xì)胞可通過(guò)免疫逃逸來(lái)逃避NK 細(xì)胞殺傷。程序性死亡受體1（programmed cell death receptor-1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1 ，PD-L1）是與T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)協(xié)同的刺激信號(hào)通路，可抑制T 淋巴細(xì)胞活化，通過(guò)抑制PD-1/PD-L1 信號(hào)通路，可有效抑制非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤的惡化并改善預(yù)后［7］。當(dāng)歸六黃湯由當(dāng)歸、黃芪、生地黃、黃連、黃柏、黃芩和熟地黃組成，是中醫(yī)治療盜汗的經(jīng)典名方，對(duì)治療甲狀腺炎、恢復(fù)患者免疫平衡狀態(tài)和緩解病情等效果顯著［8-9］。本研究建立PCa 荷瘤小鼠模型，明確當(dāng)歸六黃湯對(duì)其免疫功能的影響，為臨床PCa 的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、動(dòng)物、主要試劑和儀器小鼠PCa 細(xì)胞株RM-1購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司。5周齡SPF級(jí)SD小鼠50只，均為雄性，體質(zhì)量（28±3）g，購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2016-0004。

當(dāng)歸六黃湯顆粒［黃芪120 g，黃岑、當(dāng)歸、黃連、熟地、生地和黃柏各60 g。制備顆粒時(shí)取藥材，加8 倍量水，煎煮1 h，濾渣；加6 倍量水，煎煮1 h，過(guò)濾。2次濾液合并，濃縮，減壓，干燥，粉碎。貴州宏宇藥業(yè)制備，批號(hào)：200526，規(guī)格：15 g/袋（相當(dāng)于生藥25 g）］，注射用順鉑［齊魯制藥（海南）有限公司，批號(hào)：120724，規(guī)格：每支10 mg］，APC 抗小鼠CD4 抗體（北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司），PerCP/Cyanine 5.5 抗小鼠CD8a 抗體（上?？道噬锟萍加邢薰荆?，兔抗小鼠PD-1 抗體一抗（北京百奧來(lái)波科技有限公司），兔抗小鼠PD-L1 抗體一抗（北京義翹神州科技股份有限公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。E0244 電子天平（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CX43 顯微鏡（日本Olympus 公司），F(xiàn)ACScan 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BECTON DICK-INSON 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和建模［10］將50只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、低劑量當(dāng)歸六黃湯組、高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組（每組10只）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RM-1 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107·mL－1，取0.1 mL RM-1 細(xì)胞，分別接種于模型組、低劑量當(dāng)歸六黃湯組、高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠右前肢腋下1 點(diǎn)鐘方向，10 d 后手指觸摸到前肢腋下有皮下結(jié)節(jié)且直徑≥5 mm，表明建模成功，本實(shí)驗(yàn)中所有小鼠均建模成功。

1.3 給藥方式將當(dāng)歸六黃湯顆粒用生理鹽水按一定比例加熱至80℃，沖調(diào)配制成含生藥量為0.13 g·mL－1的母液，并攪拌至完全溶解；于4℃保存?zhèn)溆?。建模結(jié)束后次日開(kāi)始給藥，當(dāng)歸六黃湯顆粒成人每日用量為2.8 g，按照成人與大鼠劑量換算公式：大鼠劑量=成人劑量/70 kg×6.3。低劑量當(dāng)歸六黃湯組小鼠給予成人等效量灌胃，即0.25 g·kg－1·d－1，高劑量當(dāng)歸六黃湯組以成人等效劑量的2 倍灌胃，即0.50 g·kg－1·d－1，順鉑組小鼠給予2 mg·kg－1注射用順鉑0.2 mL 腹腔注射，每日1次，連續(xù)用藥15 d，對(duì)照組和模型組小鼠給予等量生理鹽水。給藥結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)檢測(cè)各組小鼠眼眶取血1 mL 置于冷凝管中，于－80℃存放待用。采用2% 戊巴比妥將各組小鼠麻醉后脫頸處死并稱(chēng)質(zhì)量，取出脾臟和胸腺采用濾紙吸干后分別稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)。脾臟系數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量，胸腺系數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.5 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率檢測(cè)于小鼠右前肢腋下取出腫瘤結(jié)節(jié)，測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑a（mm）及與a 垂直的最短直徑b（mm），計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積，并計(jì)算抑瘤率。腫瘤體積=ab2/2（mm3），抑瘤率=（模型組小鼠平均瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組小鼠平均瘤質(zhì)量）/模型組小鼠平均瘤質(zhì)量×100%。

1.6 HE 染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)采用4% 多聚甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋后切片，切片厚度為4 μm。采用二甲苯Ⅰ和Ⅱ分別脫蠟5 min 后，于由低到高濃度酒精中吸取水分，后采用蘇木素染色5 min，經(jīng)自來(lái)水沖洗后，將切片浸入返藍(lán)液中60 s，后采用自來(lái)水進(jìn)行洗滌。浸入95% 酒精中，滴加伊紅溶液染色2 min，并采用自來(lái)水洗滌。采用不同濃度酒精脫水后，采用二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，并于顯微鏡下觀察腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率從冷凝管中取300 μL 小鼠外周血置于離心管中，分別加入2 μL APC抗小鼠CD4抗體，5 μL PerCP/Cyanine 5.5 抗小鼠CD8a 抗體，4℃避光孵育30 min。于離心管中加入2 mL 紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，10 min 后，1 000 r·min－1、半徑8cm離心5min，棄去上清，將細(xì)胞沉淀采用2mLPBS重懸并洗滌，1000r·min－1、半徑8cm離心5min，棄 去上清，將沉淀分裝至流式管中，加入含1%多聚甲醛的PBS 緩沖液500 μL，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平取各組小鼠脾臟組織100 mg，經(jīng)RIPA裂解液裂解后，提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF 膜上，50 g·L－1脫脂奶粉封閉2h后，分別加入兔抗小鼠PD-1 抗體一抗（1∶1000）、兔抗小鼠PD-L1 抗體一抗（1∶1 000），4℃培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜；洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶4 000），室溫封閉2 h，經(jīng)ECL 顯色后，曝光膠片，采用Image J蛋白分析軟件進(jìn)行定量分析。以GAPDH 為內(nèi)參，PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá) 水平=PD-1 和PD-L1 蛋白積分吸光度（integral absorbance，IA）值/內(nèi)參IA。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，各組小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、腫瘤體積、抑瘤率、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率、脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，采用±s 表示，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量當(dāng)歸六黃湯組、高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)降低（P＜0.05）；與低劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)降低（P＜0.05）；與高劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠脾臟系數(shù)及胸腺系數(shù)降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)Tab.1 Spleen coefficients and thymus coefficients of mice in various groups [n=10,±s,wB/(mg·g－1)]

表1 各組小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)Tab.1 Spleen coefficients and thymus coefficients of mice in various groups [n=10,±s,wB/(mg·g－1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；○P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.

Group Control Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP Spleen coefficient 5.88±0.62 9.04±0.91*8.19±0.83△7.42±0.77△#6.63±0.69△#○26.142＜0.001 Thymus coefficient 0.43±0.06 0.97±0.11*0.85±0.10△0.69±0.08△#0.58±0.07△#○61.730＜0.001

2.2 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率與模型組比較，低劑量當(dāng)歸六黃湯組、高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05）；與低劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）；與高劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠腫瘤體積減?。≒＜0.05），抑瘤率升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率Tab.2 Tumor volumes and inhibitory rates of tumor of mice in various groups (n=10，±s）

表2 各組小鼠腫瘤體積和抑瘤率Tab.2 Tumor volumes and inhibitory rates of tumor of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05 compared with model group；△P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；#P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.“－”：No data.

Group Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP Tumor volume（V/mm3）1 367.44±152.66 1 128.69±140.68*△873.42±92.54*△685.17±88.23*△#59.656＜0.001 Inhibitory rate of tumor（η/%）－17.45±3.22 36.12±3.46*#49.89±3.97*△#208.727＜0.001

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE 染色結(jié)果顯示：模型組小鼠可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞分布均勻而緊密，偶有空泡；低劑量當(dāng)歸六黃湯組小鼠腫瘤細(xì)胞分布均勻且空泡增多；高劑量當(dāng)歸六黃湯組小鼠腫瘤細(xì)胞排列疏松，空泡數(shù)明顯增多；順鉑組小鼠腫瘤細(xì)胞明顯減少，分布分散，腫瘤細(xì)胞與空泡間隔分布。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×400）Fig.1 Pathomorphology of tumor tissue of mice in various groups (HE,×400)

2.4 各組小鼠外周血中CD4+和CD8+ T 淋巴細(xì)胞百分率與對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞百分率降低（P＜0.05），CD8+T淋巴細(xì)胞百分率升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量當(dāng)歸六黃湯組、高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞百分率升高（P＜0.05），CD8+T淋巴細(xì)胞百分率降低（P＜0.05）；與低劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞百分率升高（P＜0.05），CD8+T淋巴細(xì)胞百分率降低（P＜0.05）；與高劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞百分率升高（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞細(xì)胞百分率降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2 和表3。

表3 各組小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率Tab.3 Percentages of CD4+ and CD8+Tlymphocytes in peripheral blood of mice in various groups (n=10,±s,η/%)

表3 各組小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率Tab.3 Percentages of CD4+ and CD8+Tlymphocytes in peripheral blood of mice in various groups (n=10,±s,η/%)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；○P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.

Group Control Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP Percentage of CD4+Tlymphocytes 33.35±4.34 16.12±2.25*20.48±2.31*△24.27±2.49*△#29.49±3.28*△#○51.244＜0.01 Percentage of CD8+ T lymphocytes 12.16±1.46 26.89±2.97*22.76±2.65*△18.46±2.16*△#15.75±1.88*△#○63.907＜0.01

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率Fig.2 Percentages of CD4+ and CD8+ lymphocytes in peripheral blood of mice in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量當(dāng)歸六黃湯組、高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與低劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，高劑量當(dāng)歸六黃湯組和順鉑組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與高劑量當(dāng)歸六黃湯組比較，順鉑組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和表4。

表4 各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of PD-1 and PD-L1 proteins in spleen tissue of mice in various groups (n=10，±s）

表4 各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of PD-1 and PD-L1 proteins in spleen tissue of mice in various groups (n=10，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low dose of Danggui Liuhuang Decoction group；○P＜0.05 compared with high dose of Danggui Liuhuang Decoction group.

Group Control Model Danggui Liuhuang Decontion Low dose High dose Cisplatin FP PD-1 0.43±0.05 1.24±0.13*1.03±0.11*△0.88±0.09*△#0.62±0.07*△#○116.348＜0.001 PD-L1 0.45±0.06 1.26±0.14*1.07±0.13*△0.86±0.10*△#0.67±0.08*△#○90.327＜0.001

圖3 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of PD-1 and PD-L1 proteins in spleen tissue of mice in various groups

3 討 論

PCa 是人類(lèi)特有的疾病，死亡率僅次于肺癌，嚴(yán)重威脅男性健康。引起PCa 的病因尚未完全查明，目前認(rèn)為種族、遺傳、性活動(dòng)和飲食習(xí)慣等均是該病的致病因素，歐美國(guó)家男性、有家族病史者、性活動(dòng)頻繁者及高脂飲食者等患PCa 的風(fēng)險(xiǎn)及發(fā)病率偏高。當(dāng)歸六黃湯是中醫(yī)方劑，在臨床上治療甲狀腺功能亢進(jìn)和結(jié)核病等效果顯著，具有抗菌、抗炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等功能［11］。本實(shí)驗(yàn)比較PCa 荷瘤小鼠相關(guān)指標(biāo)，探討當(dāng)歸六黃湯對(duì)PCa 荷瘤小鼠免疫功能的影響及相關(guān)作用機(jī)制，為PCa 的臨床治療提供依據(jù)。

現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為PCa 病位在精室，與腎、肝和脾等關(guān)系密切，以精室虧虛、體虛為本，濕熱為標(biāo)，濕熱蘊(yùn)結(jié)下焦為主要病機(jī)。當(dāng)歸六黃湯主要成分有當(dāng)歸、黃芪、生地黃、黃連、黃柏、黃芩和熟地黃等，主治發(fā)熱、盜汗、面赤心煩和口干舌燥等，有滋陰清熱功效。當(dāng)歸不僅可補(bǔ)血活血，還可潤(rùn)腸通便［12］；生地黃清熱生津養(yǎng)陰涼血，治療陰虛內(nèi)熱；黃連清熱燥濕，瀉火解毒；黃柏清熱解毒，瀉火燥濕；黃芩濕熱瀉?。?3］；黃芪治療表虛盜汗，氣滯濕 阻［14］；地黃滋陰補(bǔ)血，治 療腰膝痿弱。研究［15］表明：當(dāng)歸及其活性成分可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，當(dāng)歸相關(guān)提取物可提高結(jié)直腸癌圍術(shù)期患者機(jī)體免疫功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用［16］。研究［17］顯示：黃芪的主要成分可提高機(jī)體免疫力，協(xié)同增強(qiáng)常規(guī)化療藥物順鉑的抗癌作用，作為替代免疫療法用于肺癌患者維持治療具有潛在可行性。黃芪多糖可以上調(diào)相關(guān)因子水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞增殖，達(dá)到抗腫瘤的目的［18］。本研究結(jié)果顯示：當(dāng)歸六黃湯可降低小鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)，減小腫瘤體積，提高抑瘤率，改善T 淋巴細(xì)胞亞群百分率，改善腫瘤組織病理變化，提示當(dāng)歸六黃湯可通過(guò)改善免疫器官功能、T 淋巴細(xì)胞亞群比例和腫瘤組織病理形態(tài)表現(xiàn)，達(dá)到抗腫瘤及改善免疫功能的目的。

PD-1/PD-L1 是與免疫功能相關(guān)的信號(hào)通路。正常情況下，T 淋巴細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，PD-1 呈低表達(dá)，當(dāng)T 淋巴細(xì)胞被激活可引起PD-1 表達(dá)上調(diào)。PD-L1 與PD-1 相互作用可抑制T 淋巴細(xì)胞活性，抑制其增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究［19］顯示：PD-1 和PD-L1 的表達(dá)可通過(guò)創(chuàng)建免疫抑制腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)小鼠PCa 的發(fā)展。研究［20］顯示：阻斷PD-1/PD-L1 信號(hào)通路聯(lián)合放療，可增強(qiáng)小鼠T 淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫活性，誘導(dǎo)針對(duì)PCa 的強(qiáng)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示：當(dāng)歸六黃湯可降低PCa 荷瘤小鼠脾臟組織中PD-1 和PD-L1 蛋白表達(dá)水平，且與劑量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示當(dāng)歸六黃湯對(duì)免疫功能的改善作用，可能與抑制PD-1/PD-L1 信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，當(dāng)歸六黃湯可增強(qiáng)PCa 荷瘤小鼠免疫功能，可能通過(guò)抑制PD-1/PD-L1 信號(hào)通路發(fā)揮作用，為臨床PCa 的治療提供新的治療方案。