頭孢曲松對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)的影響

龔澤華, 劉俊杰, 徐繼偉, 李建民

（1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 唐山 063000）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是三大腦血管疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類健康［1］。早期腦損傷（early brain injury，EBI）是導(dǎo)致SAH 患者預(yù)后不良的主要因素，其涉及的病理過程包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和凋亡等［2］。其中，炎癥反應(yīng)在SAH 早期相對活躍，是EBI中最重要的病理過程之一［3］。在SAH早期，諸如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素33（interleukin-33，IL-33）等炎癥因子水平明顯升高，這些炎癥因子能夠造成廣泛的炎癥反應(yīng)，引起血管收縮甚至痙攣，加 重SAH 后 的EBI［3］。研究［4］顯示：采用藥物干預(yù)炎癥因子及其受體的釋放能夠明顯減輕SAH 后的EBI，改善患者神經(jīng)功能預(yù)后。

頭孢曲松（ceftriaxone，CEF）是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其具有低毒性和廣譜抗菌性而被大量應(yīng)用于感染性疾 病的治療［5］。近年 來研究［6-7］顯示：CEF 可以降低帕金森病和腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中炎癥因子的表達(dá)水平。但關(guān)于CEF 與SAH后炎癥因子表達(dá)的研究較少，本研究制備大鼠SAH 模型，探討采用CEF 對SAH 后炎癥反應(yīng)的影響，為CEF 的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組48只SD大鼠，成年雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量300～400 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0002。采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠分為假手術(shù)組、SAH組和CEF組，每組16只。

1.2 藥品、主要試劑和儀器CEF 購自齊魯制藥有限公司（批號(hào)：0080418）。IL-1β、IL-6、IL-33和TNF-α ELISA 試劑盒及GFAP 單克隆抗體購自美國SantaCruz 公司。OlympusBX53 型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司，LeicaRM2235 型切片機(jī)購自德國LEICA 公司，Motic-6.0 圖像采集和分析系統(tǒng)購自西班牙Motic 集團(tuán)。

1.3 動(dòng)物模型制備和藥物干預(yù)參考BARRY 等［8］的研究，采用改進(jìn)后的血管內(nèi)穿刺法建立SAH 大鼠模型。取實(shí)驗(yàn)大鼠，稱質(zhì)量后腹腔注射10% 水合氯醛（3.5 mL·kg－1）麻醉。待麻醉充分起效后，將大鼠固定于解剖臺(tái)上，取仰臥位，術(shù)區(qū)備皮、消毒、鋪巾，在頸部正中作一切口，鈍性分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，隨后結(jié)扎并離斷頸外動(dòng)脈，牽引頸外動(dòng)脈至與頸內(nèi)動(dòng)脈呈一直線，去除頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾。將穿刺線由頸外動(dòng)脈插入，向頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段進(jìn)線，觸及阻力后再前進(jìn)1.0～1.5 mm 刺破血管，停留15s后抽出穿刺線，隨后結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合頸部切口。手術(shù)期間注意保暖，術(shù)后將大鼠用毛巾包裹完好，避免著涼。假手術(shù)組大鼠行頸動(dòng)脈穿刺，但不刺破血管；CEF組大鼠模型制備方法同SAH組，術(shù)前5 d 經(jīng)腹腔注射CEF（200 mg·kg－1），每日1次。

1.4 各組大鼠神經(jīng)功能評分在SAH 模型建立成功后24 h，采用改進(jìn)后的Garcia 評分表［9］，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。其中自主活動(dòng)、四肢行動(dòng)度、前肢伸展能力評分均為0～3分；攀爬能力、軀干觸碰反應(yīng)和觸須反應(yīng)評分均為1～3分；合計(jì)總分?？偡肿畹蜑?分，滿分為18分，得分越低，說明神經(jīng)系統(tǒng)損傷越嚴(yán)重。

1.5 HE 染色觀察各組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)建模后24 h，采用10% 水合氯醛深度麻醉大鼠。待麻醉起效后打開胸腔，在左心室底部刺入灌注針。剪破右心耳，緩慢勻速灌注0.1 mmol·L－1PBS 溶液，至右心耳流出液變澄清，改勻速推注4% 多聚甲醛溶液至大鼠肝臟發(fā)白。灌注完成后，斷頭取腦，置于甲醛溶液內(nèi)固定24 h。以視交叉為中心，冠狀切取腦組織，采用石蠟包埋。將包埋好的腦組織切成厚度約5 μm 的薄片，置于二甲苯中脫蠟固定20 min。隨后在體積分?jǐn)?shù)為100%、95%、85% 和75% 的乙醇中均脫水5 min，經(jīng)蒸餾水洗滌后，放入蘇木素中染色15 min，隨后在1% 鹽酸中靜置5 s，再次采用蒸餾水洗滌。而后在伊紅溶液中復(fù)染5 min，分別在75%、85%、95% 和100%的乙醇中均脫水2 min，滴加二甲苯做透明處理，最后以中性樹膠密封貼片。在光學(xué)電子顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)。每張切片選取5個(gè)視野，采用Motic-6.0 圖像采集和分析系統(tǒng)觀察高倍視野下神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)，并計(jì)算其平均值。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志性產(chǎn)物，本研究采用GFAP 抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。在室溫下，將制備好的腦組織切片復(fù)溫60 min。然后將切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。經(jīng)新鮮的3%H2O2室溫避光封閉，10 min 后采用蒸餾水沖洗5 min，重復(fù)4次。再用胰酶抗原修復(fù)（胰酶1∶4 稀釋），隨后滴入GFAP單克隆抗體（1∶1 000 稀釋）置于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜，第2天采用PBS緩沖液漂洗10min，重復(fù)3次。然后滴加二抗，放置于37℃溫箱內(nèi)孵育30 min，再經(jīng)PBS 緩沖液漂洗10 min，重復(fù)3次后，按說明書添加DAB 顯色劑顯色。PBS 溶液漂洗5 min，重復(fù)3次，隨后在蘇木素溶液中進(jìn)行復(fù)染，采用流水沖洗后，進(jìn)行梯度乙醇脫水，滴加二甲苯進(jìn)行透明處理，最后以中性樹膠密封貼片。鏡下觀察并攝片，每張切片選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)，即星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)。

1.7 ELISA法檢測各組大鼠腦組織中IL-1β 、IL-33、IL-6 和TNF-α 水平神經(jīng)功能評分后，每組選取6只大鼠。按照3.5 mL·kg－1的劑量給予大鼠10% 水合氯醛，經(jīng)腹腔注射進(jìn)行麻醉，灌注完成 后，斷頭取腦。取20mg新鮮腦組織，置于200μL含有0.01mol·L－1苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液中，勻漿裂解腦組織，離心并收集上清液。按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-33、IL-6 和TNF-α 水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠神經(jīng)功能評分，神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)及腦組織中IL-1β、IL-33、IL-6 和TNF-α水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分與假手術(shù)組比較，SAH組大鼠Garcia 評分明顯降低（P＜0.05）；與SAH組比較，CEF組大鼠Garcia 評分明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups(n=10，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups(n=10，±s）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with SAH group.

Group Sham operation SAH CEF Garcia score 17.60±0.52 7.00±0.82*10.70±0.95△

2.2 各組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和壞死數(shù)假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞分布排列有序、形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞勻稱，細(xì)胞核居中，染色清楚；SAH組大鼠的神經(jīng)細(xì)胞排列雜亂，形態(tài)不規(guī)則，呈錐狀，細(xì)胞核收縮、破裂和溶解；與SAH組比較，CEF組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞受損情況明顯改善，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞核收縮、破裂和溶解現(xiàn)象明顯改善。見圖1。與假手術(shù)組比較，SAH組大鼠神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)明顯增多（P＜0.05）；與SAH組比較，CEF組大鼠神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(HE，×400)Fig.1 Morphology of nerve cells in brain tissue of rats in various groups (HE，×400)

表2 各組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)Tab.2 Numbers of necrosis nerve cells in brain tissue of rats in various groups (n=10，±s）

表2 各組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)Tab.2 Numbers of necrosis nerve cells in brain tissue of rats in various groups (n=10，±s）

* P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with SAH group.

Group Sham operation SAH CEF Number of necrosis nerve cells 1.59±0.34 45.85±3.81*31.34±3.56△

2.3 各組大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)GFAP 陽性細(xì)胞形態(tài)多呈 “分支狀”，胞體較小，以胞質(zhì)染色為主，突起增粗延長且長短不一。見圖2。與假手術(shù)組比較，SAH組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與SAH組比較，CEF組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)Tab.3 Numbers of activated astrocytes of rats in various groups (n=10，±s）

表3 各組大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)Tab.3 Numbers of activated astrocytes of rats in various groups (n=10，±s）

* P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with SAH group.

Group Sham operation SAH CEF Number of activated astrocytes 5.35±1.03 17.22±2.69*11.95±1.42△

圖2 各組大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況（免疫組織化學(xué)，×400）Fig.2 Activation of astrocytes in brain tissue of rats in various groups (Immunohistochemistry, ×400)

2.4 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-33、IL-6和TNF-α水平與假手術(shù)組比較，SAH組大鼠腦組織中IL-1β、IL-33、IL-6 和TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與SAH組比較，CEF組大鼠腦組織中IL-1β、IL-33、IL-6 和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-33、IL-6 和TNF-α 水平Fig.3 Levels of IL-1β, IL-33, IL-6 ,and TNF-α in brain tissue of rats in various groups

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：SAH 后，大鼠神經(jīng)功能損害，炎癥因子表達(dá)明顯增加，且壞死神經(jīng)細(xì)胞和活化星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，而提前應(yīng)用CEF處理能夠明顯抑 制IL-1β、IL-33、IL-6 和TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，提高神經(jīng)功能評分。與本研究結(jié)果一致，F(xiàn)ENG 等［10］發(fā)現(xiàn)：CEF 在SAH 大鼠模型中的應(yīng)用效果顯著，包括降低死亡率、改善認(rèn)知障礙和抗海馬細(xì)胞凋亡。此外，TH?NE-REINEKE 等［6］研究顯示：CEF 治療可以明顯降低急性中風(fēng)的死亡率，改善神經(jīng)功能。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知：EBI 時(shí)CEF 可以提供神經(jīng)保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)屬于損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP），且呈級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。在SAH 早期，血腦屏障被廣泛破壞，通透性增加，血紅蛋白裂解產(chǎn)物進(jìn)入腦組織，作為抗原物質(zhì)，裂解產(chǎn)物會(huì)激活炎癥細(xì)胞，促使炎癥介質(zhì)釋放，引起腦組織的炎癥反應(yīng)，參與SAH 的早期腦損傷［11-12］。研究［13-14］表明：抑制TNF-α 的表達(dá)可以減輕SAH 后神經(jīng)功能損害的程度。IL-1β是SAH 后EBI中最重要的促炎癥因子，通過與家族受體結(jié)合參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞浸潤。IL-1β 水平與機(jī)體組織損傷程度有一定的相互關(guān)系［15］。IL-6 主要由T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，其表達(dá)水平與腦組織損傷程度有關(guān)，是衡量腦組織損傷程度和炎癥反應(yīng)大小的重要指標(biāo)［15-17］。

本研究通過檢測腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平來判斷炎癥反應(yīng)程度。本研究結(jié)果顯示：SAH 后大鼠腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎癥因子水平明顯提高，而經(jīng)CEF 預(yù)處理后上述炎癥因子水平明顯降低，表明CEF 對SAH 后的炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用。本研究結(jié)果與YANG 等［18］在缺血再灌注動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中CEF 的作用一致。IL-33和IL-1β同屬于IL-1家族，參加多種病理反應(yīng)，研究［19］證 實(shí)：SAH可以增加大鼠腦組織 中IL-33 水平，而且IL-33 主要在神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與了炎癥反應(yīng)，研究［20-21］顯示：紅細(xì)胞代謝產(chǎn)物積聚于蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中黏附因子水平，隨后募集血液中的吞噬細(xì)胞，進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，發(fā)生脫顆粒，然后釋放大量炎性產(chǎn)物，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，大量神經(jīng)細(xì)胞被裂解破壞，腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞也被激活，進(jìn)一步加重SAH 后腦損傷。本研究中，SAH組大鼠腦組織中IL-33 水平升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞也明顯活化，而CEF組大鼠腦組織中IL-33 水平明顯降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)也明顯減少，提示CEF 的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其減輕炎癥反應(yīng)和抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。

本研究結(jié)果表明：CEF 可以減輕SAH 后EBI的炎癥反應(yīng)和腦組織損傷，表現(xiàn)為抑制TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。SAH 后EBI 所涉及的病理過程十分復(fù)雜，除了炎癥因子的釋放外，還有腦水腫、氧化應(yīng)激、血腦屏障功能障礙、細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡等［2］。本課題組前期研究［22］顯示：CEF在SAH中的神經(jīng)保護(hù)作用還可能與其上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞自噬和減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此本文作者推測：CEF對SAH大鼠EBI 的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能還包括了上述作用之間復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，今后本課題組將對其具體的影響機(jī)制進(jìn)一步深入研究，為CEF 用于SAH 患者的臨床治療提供依據(jù)。