外源性神經(jīng)生長因子對形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜組織的保護作用及其機制

張 新, 巨朝娟, 金 鑫, 熊朝暉, 趙 燕

（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050031）

近視是指在放松狀態(tài)下，平行光線經(jīng)眼球屈光系統(tǒng)后聚焦在視網(wǎng)膜前的屈光狀態(tài)。近年來，近視的發(fā)生率在我國呈上升趨勢，其中病理性近視的發(fā)生會引起鞏膜、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)病變，最終導致視覺損傷，嚴重影響青少年的正常生活［1-2］。Wnt/β -catenin 信號通路是機體中重要的信號通路，與動物胚胎組織發(fā)育、干細胞分化和細胞增殖密切相關［3］。前期研究［4-5］顯示：形覺剝奪性近視（formdeprivation myopia，F(xiàn)DM）動物模型中鞏膜成纖維細胞的Wnt/β-catenin 信號通路被激活。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子，通過促進乙酰膽堿的合成激活Wnt/β-catenin信號通路，從而減輕膽堿能神經(jīng)元的功能障 礙［6］。研究［7-9］顯示：部分活性 因子如成 纖 維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等參與近視的發(fā)生發(fā)展過程。但目前國內(nèi)外對NGF的研究較少，尚無關于NGF對FDM動物Wnt/β-catenin 信號通路影響的相關研究報道。本研究建立豚鼠FDM 模型，給予外源性NGF 干預，觀察NGF 對FDM 的保護作用，并闡明其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器雄性豚鼠48只，2月齡，體質(zhì)量100～130 g，購自中科生物制藥股份有限公司，動物使用許可證號： SYXK（冀）2019-001。適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：室溫25℃±2℃，相對濕度45%～55%，晝夜交替飼養(yǎng)，自由進水和攝食。復方托吡卡胺滴眼液和鹽酸奧布卡因滴眼液（參天制藥株式會社），NGF（美國Sigma公司），TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司），鼠抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 β，GSK-3β）抗體和兔抗β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體（美國Abcam 公司），鼠抗β-actin 抗體（南京金斯瑞生物科技有限公司）。SW-2100 型眼科A/B 超聲診斷儀（天津市索維電子科技有限公司），CX21型顯微鏡（日本Olympus 公司），9700 型PCR 擴增儀（上海賽默科技生物發(fā)展有限公司），GE-100 型凝膠電泳儀（杭州博日科技有限公司）。

1.2 FDM 模型建立、分組和給藥將48只豚鼠隨機分為對照組、模型組、低濃度NGF組和高濃度NGF組，每組12只。依據(jù)參考文獻［10］ 方法建立豚鼠FDM 模型： 采用單眼遮蓋法，除對照組外，其余各組豚鼠均右眼戴－10.0 屈光度（diopte，D）透鏡，左眼不進行任何處理。造模10 d后，低濃度NGF組豚鼠右眼注射500 BU NGF，高濃度NGF組豚鼠右眼注射1 000 BU NGF，連續(xù)給藥21 d，左眼不進行任何處理。

1.3 各組豚鼠雙眼D 和眼軸長度檢測給藥結束后由同一名實驗人員分別采用紅外偏心驗光儀和眼科A/B 超聲診斷儀檢測各組豚鼠雙眼D 和眼軸長度，在測量前30 min 給予各組豚鼠1% 復方托吡卡胺散瞳，于暗室內(nèi)檢影，以D 記作等效球鏡的一半。采用鹽酸奧布卡因滴眼液點雙眼表面麻醉豚鼠，采用眼科A/B 超聲診斷儀測量各組豚鼠眼軸長度。

1.4 HE 染色觀察各組豚鼠鞏膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)各組豚鼠脫頸椎處死后摘取雙側眼球，于冰臺上沿角膜緣剪開眼球，分離眼前節(jié)和玻璃體，取鞏膜組織，采用多聚甲醛溶液固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片（切片厚度5 μm），采用二甲苯脫蠟，乙醇洗脫，浸洗后采用HE 染色，洗滌，采用乙醇脫水，中性樹膠封固，置于光學顯微鏡下觀察各組豚鼠鞏膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantificative PCR，RT-qPCR）法檢測各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β、β-catenin 和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表達水平各組取6只豚鼠，分離右側鞏膜組織，按照試劑盒說明書提取總RNA 并檢測濃度。GSK-3β、β-catenin 和VEGF mRNA 特 異性引物 根據(jù)基因CDS 序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設計及合成。GSK-3β 引物：上游5′-CCTTAACCTGGTGCTGGACT-3′，下 游5′-AGCTCTGGTGCCCTGTAGTA-3′，擴增片段長度為300 bp；β-catenin引物：上游5′-GCTGACCAAACTGCTAAATGACGA-3′，下游5′-TGTAGGGTCCCAGCGGTACAA-3′，擴增片段長度為192 bp；VEGF引 物： 上 游5′-GCAGAATCATC-ACGAAGTGG-3′，下游5′-ATCAGGGGCAC-ACAGGAT-3′，擴增片段長度為141 bp ；β -actin 引 物： 上 游5′-CACCAACTGGGACGACAT-3′，下 游5′-ATCTGGGTCATCTTCTCGC-3′，擴增片段長度為138 bp。選用25 μL 擴增體系，擴增條件：94℃預變性5 min，94℃、60 s，55℃、60 s，72℃、40 s，共35個循環(huán)，72℃、10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液充分混勻，采用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，GIS 凝膠圖像處理系統(tǒng)成像，采用圖像分析系統(tǒng)行光密度掃描，以β-actin 為內(nèi)參進行半定量分析，目的基因表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.6 免疫組織化學法檢測各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin陽性細胞率取各組豚鼠鞏膜組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟復水，采用3% 過氧化氫溶液于37℃處理10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，加 入GSK-3β 一 抗（1∶100）和β -catenin 一抗（1∶300）于4℃孵育12 h。辣根過氧化物酶復合物（horseradish peroxidase，HRP）溶液孵育2 h，DAB 顯色8min，加入蘇木素復染5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，采用中性樹膠封片。GSK-3β 陽性細胞為細胞漿呈黃褐色，β-catenin 陽性細胞為細胞漿或細胞核呈黃褐色。采用Image Pro Plus 多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析，分別計 算6個400 倍視野中的GSK-3β 和β -catenin陽性細胞率。GSK-3β 和β -catenin 陽 性細胞率＝GSK-3β 和β-catenin 陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 Western blotting 法檢測各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達水平取鞏膜組織，加入組織裂解液處理30 min ，勻漿處理，12 000 r·min－1離心10 min，收集上清液，采用蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取60 μg 蛋白樣品經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酸銨（SDSPAGE）凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜［poly（1，1-difluoroethylene），PVDF］，室溫封閉1 h。加入GSK-3β 一抗（1∶1 000）和β-catenin 一抗（1∶500），于4℃孵育過夜，加入HRP 標記的IgG 孵育2 h，加入ECL 進行顯色。采用圖像軟件Image J 進行定量分析，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值表示目的蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組豚鼠D 和眼軸長度，豚鼠鞏膜組織 中GSK-3β、β -catenin 和VEGF mRNA 表 達 水平，鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 陽性細胞率，鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達水平，符合正態(tài)分布，均以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組豚鼠雙眼D 和眼軸長度各組豚鼠左眼D 和眼軸長度比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組豚鼠右眼D 明顯降低（P＜0.05），右眼眼軸長度明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，低和高濃度NGF組豚鼠右眼D 明顯升高（P＜0.05），右眼眼軸長度明顯減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠雙眼D 和眼軸長度Tab.1 D and axis lengths of eyes of guinea pigs in various groups（n=12，±s）

表1 各組豚鼠雙眼D 和眼軸長度Tab.1 D and axis lengths of eyes of guinea pigs in various groups（n=12，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low concentration of NGF group.

Group Control Model NGF Low concentration High concentration D Right eye 3.42±0.28 0.75±0.16*1.60±0.50△2.21±0.62△#Left eye 3.36±0.31 3.40±0.48 3.33±0.41 3.43±0.44 Axis length of eye (l/mm)Right eye 7.34±0.20 10.17±0.34*8.93±0.37△8.06±0.36△#Left eye 7.40±0.23 7.56±0.28 7.50±0.22 7.44±0.30

2.2 各組豚鼠鞏膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組豚鼠鞏膜組織結構完整，細胞排列整齊，未見明顯異常。與對照組比較，模型組豚鼠鞏膜組織厚度減少，膠原纖維排列紊亂，纖維之間出現(xiàn)明顯空隙。與模型組比較，低和高濃度NGF組豚鼠鞏膜組織厚度增加，結構相對清晰；與低濃度NGF組比較，高濃度NGF組豚鼠鞏膜組織結構完整，纖維排列緊密。見圖1。

圖1 各組豚鼠鞏膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of scleral tissue of guinea pigs in various groups（HE，×200）

2.3 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β、β -catenin 和VEGF mRNA 表達水平與對照組比較，模型組豚鼠右眼鞏膜組織中β-catenin 和VEGF mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高濃度NGF組豚鼠右眼鞏膜組織中GSK-3β mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05），β-catenin 和VEGF mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）；與低濃度NGF組比較，高濃度NGF組豚鼠右眼鞏膜組織中GSK-3β mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05），β-catenin 和VEGF mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β、β-catenin 和VEGF mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of GSK-3β, β-catenin，and VEGF mRNA in scleral tissue of guinea pigs in various groups (n=6，±s）

表2 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β、β-catenin 和VEGF mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of GSK-3β, β-catenin，and VEGF mRNA in scleral tissue of guinea pigs in various groups (n=6，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low concentration of NGF group.

Group Control Model NGF Low concentration High concentration GSK-3β mRNA 0.340±0.021 0.329±0.022 0.283±0.023△0.215±0.020△#β-catenin mRNA 0.162±0.013 0.261±0.019*0.359±0.033△0.415±0.029△#VEGF mRNA 0.114±0.014 0.293±0.024*0.342±0.026△0.387±0.033△#

2.4 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 陽性細胞率對照組豚鼠鞏膜組織中有少量GSK-3β和β-catenin 蛋白表達。與對照組比較，模型組豚鼠虹膜組織中β-catenin 陽性細胞率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高濃度NGF組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 陽性細胞率降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），β-catenin 陽性細胞率明顯升高（P＜0.05）；與低濃度NGF組比較，高濃度NGF組豚鼠鞏膜組織中β-catenin 陽性細胞率明顯升高（P＜0.05）。見圖2 和表3。

表3 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 陽性細胞率Tab.3 Rates of GSK-3β 和β-catenin positive cells in scleral tissue of guinea pigs in various groups（n=6，x±s，η/%）

圖2 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 陽性細胞的表達（免疫組織化學，×400）Fig.2 Expressions of GSK-3 β and β -catenin positive cells in scleral tissue of guinea pigs in various groups（Immunohistochemistry，×400）

2.5 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達水平與對照組比較，模型組豚鼠鞏膜組織中β-catenin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高濃度NGF組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），β-catenin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與低濃度NGF組比較，高濃度NGF組豚鼠鞏膜組織中β -catenin 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖3 和表4。

表4 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of GSK-3β and β -catenin proteins in scleral tissue of guinea pigs in various groups（n=6，±s）

表4 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of GSK-3β and β -catenin proteins in scleral tissue of guinea pigs in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with low concentration of NGF group.

Group Control Model NGF Low concentration High concentration GSK-3β protein 0.280±0.032 0.264±0.035 0.143±0.030△0.131±0.026△β-catenin protein 0.145±0.026 0.189±0.021*0.254±0.035△0.362±0.037△#

圖3 各組豚鼠鞏膜組織中GSK-3β 和β-catenin 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of GSK-3β and β-catenin proteins in scleral tissue of guinea pigs in various groups

3 討 論

目前國內(nèi)外學者在治療近視的研究中普遍采用豚鼠建立FDM 模型，其主要原因是豚鼠具有發(fā)育完善的視覺系統(tǒng)和類似人類的眼球結構［11］。鞏膜是決定眼球形狀和焦距的結締組織，近視的病理特點主要以鞏膜組織變薄和鞏膜細胞外基質(zhì)結構變化為主［12］。本研究結果顯示：模型組豚鼠右眼D 低于對照組，而眼軸長度則明顯增加；HE 染色結果表明：FDM 處理后豚鼠鞏膜組織變薄，膠原纖維疏松、紊亂，表明鞏膜組織細胞外基質(zhì)重塑，導致右眼D 和眼軸長度發(fā)生變化，說明豚鼠FDM 模型建立成功。

Wnt 信號通路是維持細胞增殖和生長的重要通路，參與機體免疫應激、細胞修復與重塑等生理環(huán)節(jié)，與胚胎發(fā)育、干細胞的分化和組織再生有密切關 聯(lián)［13］。GSK-3β是Wnt信號通路下游的調(diào)控酶，參與細胞分化、增殖、凋亡和炎癥反應等多種病理過 程［14］。β-catenin 是Wnt信號通路的關鍵信號分子，具有介導信號轉(zhuǎn)導和細胞間黏附作用，其在細胞中的表達水平對該通路起決定性作用，是該信號通路激活的標志，因此Wnt 信號通路也稱為Wnt/β -catenin信號通路［15］。田楠楠等［16］研究顯示：Wnt/β -catenin 信號通路可以激活VEGF mRNA，參與近視的發(fā)生發(fā)展。在正常情況下，Wnt/β -catenin信號通路在鞏膜組織中處于靜止狀態(tài)，當受到病理性損傷時，Wnt/β-catenin 信號通路被激活，參與近視的發(fā)生發(fā)展過程［17］。本研究結果顯示： 與對照組比較，模型組豚鼠右眼鞏膜組織中VEGF mRNA、β-catenin mRNA 和蛋白表達水平明顯升高，與PENG 等［18］研究結果一致，表 明FDM處理使鞏膜組織受損，β-catenin 通過提高活性抑制鞏膜細胞在異常狀態(tài)下發(fā)生凋亡，同時鞏膜組織受損促進了VEGF 表達。NGF 是基底前腦膽堿能神經(jīng)元的營養(yǎng)因子，主要通過增加神經(jīng)營養(yǎng)維持神經(jīng)突起生長和促進神經(jīng)細胞修復，保護神經(jīng)元退變［19］。采用NGF 干預后，豚鼠右眼鞏膜組織中GSK-3β mRNA 表達水平降低，VEGF 和β-catenin mRNA 及蛋白表達水平升高，表明NGF 能夠通過改善鞏膜組織膽堿能神經(jīng)元抑制GSK-3β 表達，從而促進β-catenin 表達，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，并促進VEGF 表達誘導和促進新生毛細血管形成，減輕組織損傷［20-21］。

綜上所述，病理性近視會引起鞏膜、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)病變，外源性NGF 可通過抑制GSK-3β 表達、增加β-catenin表達和激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進新生毛細血管形成，對FDM 豚鼠的鞏膜組織起保護作用。