人參皂苷Rg3 對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯致小鼠生殖功能損傷的改善作用及其機(jī)制

徐小磊, 楊玉琨, 李忠明, 李欣悅, 王 穎, 盛 杰, 張 晶, 孫秀玲,王洪艷, 曲 莉, 李 環(huán)

（1.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 吉林 132001；2.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室，吉林 吉林 132001）

研究［1］表明：在過去的50年中人類，男性生殖系統(tǒng)疾病患病率有所增加，男性精子質(zhì)量和數(shù)量都有較大幅度下降，表現(xiàn)為精子生成障礙、精子缺乏和精子活力不足。藥物治療和輔助生育技術(shù)是目前不育癥治療所采用的方法，但是大多數(shù)藥物存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，輔助生殖技術(shù)也可能會(huì)帶來一些嚴(yán)重的問題，如出生缺陷或癌癥。人參被認(rèn)為是“中草藥之王”，藥理學(xué)研究［2-4］證明：人參對(duì)生殖功能的兩個(gè)主要方面，性功能和生育能力均有影響。人參皂苷是人參中能夠調(diào)節(jié)多種代謝的活性物質(zhì)之一。人參皂苷Rg3 屬于皂苷類的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、治療糖尿病和止癢等作用。Rg3可以通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）介導(dǎo)的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路來改善子宮內(nèi)膜病變［5］，通過下調(diào)miR-26a 對(duì)抗雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性［6］，因此人參皂苷Rg3 可能成為治療男性性功能減退的潛在藥物。研究［7］顯示：人參皂苷Rg3通過縫隙連接（gap junction，GJ）細(xì)胞間通訊發(fā)揮生精保護(hù)作用，但人參皂苷Rg3 對(duì)生殖功能損傷的改善作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。

鄰苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DBP）是鄰苯二甲酸酯類的一種，是公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，DBP 可引起睪丸萎縮和生殖內(nèi)分泌激素水平改變，改變睪酮合成降低精子能動(dòng)性和精子數(shù)，引起精子形成過程的缺陷。本研究通過DBP 灌胃小鼠，同時(shí)給予人參皂苷Rg3 腹腔注射，觀察小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)、Src/PI3K/Akt 通路的mRNA 和蛋白表達(dá)的變化，探討Rg3 對(duì)DBP 誘導(dǎo)的生殖功能損傷的改善作用及其相關(guān)機(jī)制，為男性（雄性）生殖危害的防治策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器6周齡清潔級(jí)C57BL/6 雄性小鼠由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）2018-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0003。Rg3（吉林大學(xué)藥學(xué)院），DBP（美國Santa Cruz 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司），TRIzol 試劑、引物合成、PCR 反應(yīng)體系、磷酸化Src（phosphorylated Src，p-Src）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）和BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司），HE 染液（北京鼎國昌盛公司），ECL 發(fā)光試劑盒（中杉金橋公司），間隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）多克隆抗體（上海碧云天公司），山羊抗兔IgG（中山生物）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）系 統(tǒng)（美國ABI 公司），正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），WLJY-9000 彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備和分組30只6周齡清潔級(jí)C57BL/6 雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DBP組（給予400 mg·kg－1DBP）和DBP+Rg3組（給予400 mg·kg－1DBP 和20 mg·kg－1Rg3），每組10只。本課題組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，20 mg·kg－1Rg3 單獨(dú)處理組小鼠的精子密度、精子活力、精子畸形率、血清睪酮、黃體生成素和卵泡刺激素水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HE 染色后，20 mg·kg－1Rg3 單獨(dú)處理組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，生精上皮結(jié)構(gòu)完整，基底膜完整，腔內(nèi)精子含量豐富，因此本次正式實(shí)驗(yàn)未添加人參皂苷Rg3 單獨(dú)處理組。DBP組小鼠每天上午DBP 灌胃給藥1次；DBP+Rg3組小鼠每天上午DBP 灌胃給藥1次，下午Rg3 腹腔注射給藥1次；對(duì)照組小鼠給予等體積玉米油灌胃和生理鹽水腹腔注射；連續(xù)給藥5周后采用頸椎脫臼法處死小鼠，留取其睪丸和附睪組織進(jìn)行分析。

1.3 各組小鼠精子質(zhì)量分析精子濾液制備：取小鼠雙側(cè)附睪，放入平皿后加入3 mL、37℃生理鹽水，沿管腔剪碎附睪組織，靜置1～2 min 后制備精子混懸液，將其滴加到預(yù)溫的精子計(jì)數(shù)板上，取4個(gè)視野，在2 min 內(nèi)采用WLJY-9000 型精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)完成精子質(zhì)量分析。檢測(cè)指標(biāo)包括精子密度、精子活力和精子總畸形率。

1.4 各組小鼠睪丸組織病理形態(tài)表現(xiàn)取每只小鼠的左側(cè)睪丸，將其固定在4% 多聚甲醛溶液中后常規(guī)進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色，制作睪丸組織切片。在200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察生精上皮細(xì)胞的層次、形態(tài)結(jié)構(gòu)和管腔受損程度。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠睪丸組織中Cx43 蛋白表達(dá)情況小鼠睪丸組織石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)（滴加0.25% 胰蛋白酶37℃恒溫孵育10 min），室溫下用山羊血清孵育10 min封閉。切片滴加Cx43兔 抗（1∶100 稀釋）4℃下孵育過夜。切片經(jīng)PBS 緩沖液洗滌后，采用HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶100 稀釋）孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，加水沖洗，鏡下拍照，棕色顆粒為Cx43 蛋白表達(dá)。

1.6 RT-qPCR法檢測(cè)睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)水平采用TRIzol 試劑提取睪丸總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，PCR 反應(yīng)體系包括7.5 μ mol·L－1上、下游引物各2.0 μL ，2× qPCR Mix 12.5 μL，cDNA 2.5 μL 和Water 8.0 μL。PCR 反應(yīng)條件： 95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、60 s，40個(gè)循環(huán)；72℃、10 min，結(jié)果采用2-ΔΔCt法分 析。引物序列： GAPDH（長(zhǎng)度 為133 bp），（F）5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，（R）5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′；Src（長(zhǎng)度為235 bp），（F）5′-CAGGCTGAGGAGTGGTACTTTGG3′，（R）5′-TGTTGAACTGGGTGCGGGA3′；Akt（長(zhǎng)度為189 bp），（F）5′-GGCAAGGTCATTCTGGTTCGA-3′，（R）5′-GCATAGGCGGTCATGGGTCT-3′；PI3K（長(zhǎng) 度 為136 bp），（F）5′-CCTCTGGGTCATAAATAGTGCG-3′，（R）5′-CACATTGTCACATAAGGGTTCTCC-3′。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠睪丸組織中p-Src、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平取約100 mg小鼠睪丸組織，置于4℃預(yù)冷裂解緩沖液中，在4℃置于均質(zhì)勻漿機(jī)中，勻漿約60 s，冰浴30 min，每隔5 min 震蕩1次確保組織完全裂解。12 000 r·min－1離 心10 min，收集上清。采 用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，將蛋白溶液加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，每孔上樣60 μg 蛋白質(zhì)，并在濃縮膠電壓75 V，分離膠用120 V 電壓下進(jìn)行電泳，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。采用TBST溶解的5%BSA封閉2h后，加 入1∶1 000兔抗鼠p-Src、p-PI3K 和p-Akt（Ser473），4℃孵育過夜，采用TBST 在室溫下脫色搖床上洗滌3次，每次5 min。加入標(biāo)有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），在37℃下?lián)u動(dòng)1 h，在TBST中洗滌3次，采用ECL 發(fā)光，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin 條帶灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠平均體質(zhì)量，精子密度，精子活力，精子畸形率，小鼠睪丸組織中Src、PI3K和Akt mRNA 表達(dá)水平，小鼠睪丸組織中p-Src、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以-±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠平均體質(zhì)量均增加，但組間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of mice in various groups (n=10,-±s,m/g)

表1 各組小鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of mice in various groups (n=10,-±s,m/g)

Group Control DBP DBP+Rg3 Body weight(week) 0 19.53±0.83 19.89±1.07 19.93±1.94 1 20.03±1.08 20.21±1.36 20.08±1.56 2 20.96±1.02 20.98±0.98 20.96±1.40 3 21.90±1.54 22.68±1.59 21.86±1.48 4 22.56±1.60 22.64±1.91 22.84±1.56 5 23.57±1.56 23.17±1.30 23.29±1.47

2.2 各組小鼠精子密度、精子活力和精子總畸形率與對(duì)照組比較，DBP組小鼠精子密度和精子活力均明顯降低（P＜0.01）；與DBP組 比 較，DBP+Rg3組小鼠精子密度和精子活力均明顯升高（P＜0.01）。各組小鼠精子總畸形率組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠精子密度（A)、精子活力(B)和精子總畸形率（C）Fig.1 Sperm densities（A）, sperm motilities(B), and total malformation rates of sperm(C) of mice in various groups

2.3 各組小鼠睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)正常，生精上皮結(jié)構(gòu)和基底膜完整，間質(zhì)細(xì)胞排列均勻；與對(duì)照組比較，DBP組小鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)有明顯變化，管腔中有細(xì)胞脫落，支持細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，間質(zhì)細(xì)胞排列紊亂；與DBP組比較，DBP+Rg3組小鼠睪丸結(jié)構(gòu)趨于正常，支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，曲細(xì)精管排列比較緊密規(guī)則，管腔中無脫落細(xì)胞。見圖2。

圖2 各組小鼠睪丸組織形態(tài)表現(xiàn)（HE，×200）Fig.2 Morphology of testis tissue of mice in various groups (HE，×200)

2.4 各組小鼠睪丸組織中Cx43 蛋白表達(dá)情況免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示：DBP組小鼠睪丸組織中Cx43 蛋白表達(dá)量明顯降低，而人參皂苷Rg3組小鼠睪丸組織中Cx43 蛋白的表達(dá)量增多。見圖3。

圖3 各組小鼠睪丸組織中Cx43 蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)，×200）Fig.3 Expressions of CX43 protein in testis tissue of mice in various groups (Immunohistochemistry,×200)

2.5 各組小鼠睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA表達(dá)水平RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，DBP組小鼠睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與DBP組比較，DBP+Rg3組小鼠睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組小鼠睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of Src,PI3K,and Akt mRNA in testis tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠睪丸組織中p-Src、p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，DBP組小鼠睪丸組織中p-Src、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與DBP組比較，DBP+Rg3組小鼠睪丸組織中p-Src、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組小鼠睪丸組織中p-Src、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of p-Src,p-PI3K, and p-Akt proteins in testis tissue of mice in various groups

3 討 論

人參皂苷Rg3 是紅參中特有的皂苷，有研究［8］顯示：富含人參皂苷Rg3 的人參提取物在預(yù)防熱應(yīng)激誘導(dǎo)的精子變化中起重要作用。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，DBP組小鼠精子密度和精子活力均降低，說明DBP 染毒可以減少精子數(shù)量并影響精子生存能力，使精子生成出現(xiàn)障礙［9］；與DBP組比較，DBP+Rg3組小鼠精子密度和精子活力均有所升高，而各組小鼠精子總畸形率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Rg3 可以逆轉(zhuǎn)DBP 誘導(dǎo)的精子密度、使精子活力下降，保護(hù)精子發(fā)生。小鼠睪丸組織HE 染色結(jié)果顯示：DBP 可致睪丸組織生精上皮變薄、細(xì)胞排列紊亂、管腔中有生精細(xì)胞脫落，而人參皂苷Rg3 可明顯修復(fù)DBP 導(dǎo)致的睪丸組織損傷，提示DBP 可損害睪丸組織而出現(xiàn)病理學(xué)改變［10］，人參皂苷Rg3 可減輕小鼠睪丸組織損傷。有研究［11-12］顯示：人參皂苷Rg1 可改善鎘引起的大鼠睪丸損傷，人參皂苷Rg1、Rh1 和Ppt 對(duì)棉酚誘導(dǎo)的睪丸損傷有修復(fù)作用。

血睪屏障是由睪丸支持細(xì)胞之間的緊密連接形成的一個(gè)血管和生精小管之間的物理屏障，其為精子生成提供必要的營養(yǎng)支持和穩(wěn)定的環(huán)境保障。GJ 作為血睪屏障中的重要細(xì)胞連接，其中Cx43 具有重要和獨(dú)特的生理功能［13-15］，如支持細(xì)胞特異性缺失Cx43 可導(dǎo)致小鼠不育癥，其中精原細(xì)胞不能分化成精母細(xì)胞并進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ/Ⅱ；在成年期，睪丸組織中支持細(xì)胞也不能分化［16］。本課題組前期研究［17-18］結(jié)果顯示： DBP 所致的小鼠睪丸支持細(xì)胞損傷與Cx43 表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，其可擾亂肌動(dòng)蛋白和波形蛋白等相關(guān)蛋白，間質(zhì)細(xì)胞的通透性屏障功能被破壞，導(dǎo)致生精功能受到影響。本研究結(jié)果顯示：DBP 染毒可以使Cx43 表達(dá)下降，增加血睪屏障的通透性，導(dǎo)致生精功能障礙；與DBP組比較，人參皂苷Rg3 可上調(diào)Cx43 蛋白表達(dá)，表明人參皂苷Rg3 可使血睪屏障的通透性降低，進(jìn)而保護(hù)生精功能［7］。

Src激酶家族（Src family kinases，SFKs）是一個(gè)非受體蛋白酪氨酸激酶家族，其在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控中起重要作用［19］。Src 蛋白參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中［20-23］，Src/PI3K/Akt 通路是較關(guān)鍵的一個(gè)通路，Src 調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路的活性，可以抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。本課題組前期研究［24］顯示：人參皂苷Rg1 對(duì)DBP 誘導(dǎo)的小鼠生殖功能損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與PI3K/Akt/ mTOR 信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，DBP組小鼠睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA及蛋白磷酸化水平明顯降低。與DBP組比較，DBP+Rg3組小鼠睪丸組織中Src、PI3K 和Akt mRNA及蛋白磷酸化水平升高。CHENG 等［25］研究顯示：在GJ 中c-Src 是唯一表達(dá)的SFKs 信號(hào)蛋白。也有研究［26］顯示：細(xì) 胞內(nèi)c-Src 與Cx43 的羧基尾相互作用，從而調(diào)節(jié)如細(xì)胞黏附、遷移和增殖等細(xì)胞功能；另 有 研究［27］顯示：c-Src 在Cx43 半通道活性調(diào)節(jié)中的起重要作用，這可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞中c-Src 參與神經(jīng)炎癥的機(jī)制的一部分，據(jù)此本文作者推測(cè)：Src/PI3K/Akt 通路在DBP 影響精子的產(chǎn)生、成熟和調(diào)控小鼠間質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)面發(fā)揮重要作用，直接或間接影響Cx43 的表達(dá)，Src/PI3K/Akt 通路很可能是Rg3 生精保護(hù)作用的靶標(biāo)。

綜上所述，Rg3 對(duì)DBP 誘導(dǎo)的雄性小鼠生殖功能損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是DBP 暴露抑制Src/PI3K/Akt 信號(hào)通路，使Cx43 表達(dá)水平降低，增加血睪屏障的通透性，導(dǎo)致生精功能障礙；Rg3 可能通過激活Src/PI3K/Akt 通路，使Cx43 表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮生精損傷的保護(hù)作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證。