載奧沙利鉑細(xì)胞膜囊泡納米藥物的制備及其對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷作用

黃莉莉, 劉宇軒, 方楷漪, 穆業(yè)騰, 胡楠楠, 郭 沖, 楊馥旭, 關(guān)新剛

（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013）

奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）是結(jié)腸癌臨床治療的常見(jiàn)化療藥，通過(guò)靶向結(jié)合DNA 抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮抗腫瘤功效［1-4］。盡 管OXA 具有比順鉑和卡鉑低的藥物毒性，但其對(duì)正常組織的不良反應(yīng)仍是不容忽視的問(wèn)題［5］。近年來(lái)，基于納米載體的化療藥物遞送系統(tǒng)在腫瘤治療領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。越來(lái)越多的研究［6-10］顯示：利用納米膠束、聚合物囊泡、介孔硅球和金納米粒等納米顆粒遞送化療藥物能夠改善藥物溶解性、提高藥物的腫瘤組織蓄積、延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間和降低在正常組織引起的不良反應(yīng)，顯示出較小分子化療藥物更好的腫瘤抑制增殖效果。然而，納米材料本身的生物安全性也是藥物研發(fā)不可回避的關(guān)鍵問(wèn)題，設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)安全及高效的藥物遞送系統(tǒng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)課題［11］。

細(xì)胞膜作為生物體細(xì)胞與胞外環(huán)境的天然屏障，具有其他外源性材料具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞膜納米囊泡是一種利用細(xì)胞膜材料人工制備的納米級(jí)生物囊泡，因其良好的生物相容性和可降解性及低免疫原性等優(yōu)勢(shì)成為藥物遞送領(lǐng)域的優(yōu)質(zhì)載體［12-13］。與外泌體產(chǎn)量較低不同，細(xì)胞膜囊泡可以通過(guò)擠出等方法大量制備，為其大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［14］。細(xì)胞膜囊泡和外泌體等天然囊泡均可以避免被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除，延長(zhǎng)了藥物的半衰期；作為抗腫瘤藥物輸送載體，細(xì)胞膜囊泡還具有納米顆粒在腫瘤部位獨(dú)有的增強(qiáng)通透和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR），明顯延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)，增加藥物在腫瘤部位的滯留，降低在正常組織引起的不良反應(yīng)［15-18］。

近年來(lái)，將細(xì)胞膜（尤其是紅細(xì)胞膜）包被納米顆粒制備的納米制劑在腫瘤治療領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展［19-20］，然而，利用細(xì)胞膜囊泡作為藥物遞送載體的研究卻相當(dāng)有限，現(xiàn)有細(xì)胞膜囊泡載藥體系大部分來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜［21-22］，來(lái)自正常組織細(xì)胞的細(xì)胞膜囊泡研究鮮有報(bào)道。本研究嘗試采用人胚腎HEK293T 細(xì)胞的細(xì)胞膜制備細(xì)胞膜納米囊泡（nanovesicles，NVs），通過(guò)電擊法或孵育法將OXA 擔(dān)載入細(xì)胞囊泡內(nèi)腔，得到擔(dān)載OXA 的新型納米藥物NVs@OXA，探討NVs@OXA 對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞的內(nèi)吞情況和腫瘤殺傷效果，為開(kāi)發(fā)高效低毒的新型化療藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞、人胚胎腎HEK293T 細(xì)胞和小鼠樹(shù)突狀DC2.4細(xì)胞來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)。OXA 購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，1% 青霉素- 鏈霉素溶液、MTT、PMSF、DAPIT 、DiO 和BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、改良Eagle 培養(yǎng)基（dulbecco’s modificationofEagle’s medium，DMEM）和胎牛血清（fatal bovine serun，F(xiàn)BS）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。納米粒徑分析儀Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ購(gòu)自美國(guó)麥奇克有限公司，LF10 脂質(zhì)體擠出儀購(gòu)自加拿大AVESTIN公司，CUY21EDIT Ⅱ細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀 購(gòu)自日本BEX 公司，高效液相色譜儀Agilent 1260 InfinityⅡ購(gòu)自安捷倫科技有限公司，M200 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN 公司，ACEA NovoCyte 序列流式細(xì)胞儀和倒置熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將含有細(xì)胞懸液的凍存管從液氮罐取出后37℃水浴鍋中迅速解凍，離心后棄去上清液，加入培養(yǎng)基輕柔吹勻。所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。所有細(xì)胞采用含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞密度達(dá)80%～90% 時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 NVs 的制備采用胰酶收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293T 細(xì)胞，消化后1 000 r·min－1離心5 min 收集細(xì)胞沉淀，采用PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀，采用HM培養(yǎng)基（1 mmol·L－1EDTA、20 mmol·L－1Hepes-NaOH、1 mmol·L－1PMSF、pH 7.4）進(jìn)行重懸，輕柔混勻后置于冰上的勻漿器，來(lái)回?cái)D壓50次，1 000 r·min－1離心10 min，取其上清進(jìn)行超高速離心（35 000 r·min－1，2 h）收集沉淀，PBS緩沖液重懸3次，采用DiO 染料室溫染色20 min，獲得細(xì)胞膜懸液依次通過(guò)1.0 和0.4 μm濾膜的脂質(zhì)體擠出儀，來(lái)回?cái)D壓20次，獲 得NVs。采 用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)NVs 的蛋白濃度，以mg·L－1表示。采用納米粒徑分析儀Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ檢測(cè)NVs 的粒徑分布。透射電子顯微鏡下觀察制備的NVs 的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 NVs 的細(xì)胞相容性分析將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠骨髓樹(shù)突狀DC2.4 細(xì)胞置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液（每孔5 000個(gè)細(xì)胞），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h后每孔加入蛋白終濃度分別為5、10、20、50 、75 和100 mg·L－1的NVs，空白對(duì)照孔不作處理，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后快速在每孔中加入20 μ L MTT（5 g·L－1）溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去孔中溶液，加入150 μL DMSO，充分混合震蕩1 min 后檢測(cè)490 nm 處吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=囊泡處理孔A 值/空白對(duì)照孔A 值×100%。

1.5 NVs 的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞情況為了檢測(cè)納米藥物的細(xì)胞內(nèi)吞情況，采用細(xì)胞膜特異性熒光染料DiO 對(duì)NVs 進(jìn)行標(biāo)記，制備熒光標(biāo)記的NVs。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞接種于提前放有潔凈玻片的24 孔板內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育12h后，37℃共培養(yǎng)3h后棄去孔中液體，采用PBS 緩沖液清洗3～5次，采用4% 多聚甲醛固定20 min，PBS 緩沖液清洗3～5次 后 用DAPI染色10 min，PBS 緩沖液清洗3～5次，采用封片劑進(jìn)行封片，于熒光顯微鏡下成像。采用Image J 軟件分析圖片DiO 熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度。

1.6 納米藥物NVs@OXA 的制備本研究為了將游離OXA 藥物裝載入NVs 內(nèi)腔得到納米藥物NVs@OXA，采用電擊法和孵育法制備。①電擊法。在CUY21EDIT Ⅱ細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀電擊杯中加入細(xì)胞膜NVs 與OXA（質(zhì)量比為2∶1），電轉(zhuǎn)條件：PPV 120 V，On 10 ms，Off 10 ms；PdV 25 V，On 50 ms，Off 50 ms；Cycle 5，C 940 μF。②孵育法。NVs 與游離OXA（質(zhì)量比為2∶1）在37℃孵育3h后離心去除囊泡外藥物，10 000 r·min－1離心5 min，PBS 緩沖液洗滌3次后重懸，－80℃冷凍保存。OXA 在波長(zhǎng)250 nm 處有最高吸收峰，采用高效液相色譜分析繪制OXA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)制備的納米藥物的OXA 濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.7 納米藥物NVs@OXA 體外穩(wěn)定性檢測(cè)將NVs@OXA 置于PBS 緩沖液（pH 7.4）中，在第0、3、6、9 和12天采用納米粒徑分析儀Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ檢測(cè)NVs@ OXA 的粒徑分布，以反映其體外穩(wěn)定性。

1.8 各組結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡率檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，對(duì)照組每孔加入100 μL 1.0、2.5、5.0、10.0和15.0 μmol·L－1游 離OXA（游 離OXA組）或NVs@OXA（NVs@OXA組），每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后棄去上清液，在每孔加入20 μL MTT（5 g·L－1），孵 育4h后棄去上清溶液，每孔加入150 μL DMSO，全波長(zhǎng)多功能自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）檢測(cè)490 nm 處A 值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝藥物孔A 值/空白對(duì)照孔A 值×100%。

細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：在12 孔板中以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜至細(xì)胞密度在培養(yǎng)皿內(nèi)長(zhǎng)至70%～80%，分別加入終濃度為15 μmol·L－1OXA（OXA組）或NVs@OXA（NVs@OXA組），并設(shè)對(duì)照組（不處理）37℃孵育3h后采用胰蛋白酶消化，收集懸浮細(xì) 胞 離心（1 500 r·min－1、5 min），取細(xì)胞沉淀PBS 緩沖液洗滌3～5次后加入500 μLPBS緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和Propidium Iodide 染液，混勻后在室溫避光靜置5 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、載藥效率、熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率均呈正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NVs 的粒徑分布超速離心法分離HEK293T 細(xì)胞的細(xì)胞膜，經(jīng)PBS 緩沖液重懸后采用脂質(zhì)體擠出儀得到NVs，采用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得平均粒徑為222.2 nm（圖1），透射電子顯微鏡顯示所制備的NVs 為空心球形結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1 NVs 的粒徑分布Fig.1 Distribution of particle sizes of NVs

圖2 透射電子顯微鏡下NVs 的超微結(jié)構(gòu)(Bar=200 nm)Fig.2 Ultrastructure of NVs under transmission electron microscope(Bar=200 nm)

2.2 NVs 的細(xì)胞相容性細(xì)胞相容性檢測(cè)結(jié)果顯示：在所測(cè)試的所有濃度中，樹(shù)突狀DC2.4 細(xì)胞的增殖情況未受影響，NVs 處理后細(xì)胞存活率均＞100%，顯示其具有良好的生物相容性。見(jiàn)圖3。

圖3 MTT 法檢測(cè)樹(shù)突狀DC2.4 細(xì)胞存活率Fig.3 Survival rates of dendritic DC2.4 cells detected by MTT method

2.3 NVs 的細(xì)胞內(nèi)吞情況囊泡與小鼠結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞孵育3h后，DiO 熒光標(biāo)記的綠色熒光呈斑點(diǎn)狀分布在細(xì)胞核周?chē)崾綨Vs@OXA 被腫瘤細(xì)胞攝取，分布在細(xì)胞質(zhì)中。見(jiàn)圖4。

圖4 DiO 熒光標(biāo)記的NVs 的細(xì)胞內(nèi)吞情況Fig.4 Cellular uptake of DiO-labeled NVs

2.4 納米藥物NVs@OXA 的裝載效率和穩(wěn)定性為了將OXA 載入囊泡內(nèi)腔，采用電擊法和孵育法制備納米藥物NVs@OXA。孵育法和電擊法制備得到的納米藥物OXA 的裝載效率分別為16.10%和23.16%，電擊法制備的納米藥物OXA 的裝載效率明顯高于孵育法，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)納米藥物NVs@OXA 均采用電擊法制備。穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示：納米藥物在PBS 溶液中孵育12 d 后尺寸無(wú)明顯變化，提示NVs@OXA 在體外溶液中具有較好的穩(wěn)定性。見(jiàn)圖5。

圖5 NVs@OXA 在PBS 中孵育12 d 的粒徑分布Fig.5 Distribution of particle sizes of NVs@OXA buffered in PBS for 12 d

2.5 各組結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞的存活率和細(xì)胞凋亡率游離OXA 和NVs@OXA 處理組結(jié)腸癌CT26細(xì)胞的存活率隨著藥物濃度的增加均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，在OXA濃度為10和15μmol·L－1時(shí)，與 游離OXA組比較，NVs@OXA組細(xì)胞的存活率明顯降低（P＜0.05），提示納米藥物NVs@OXA 較游離OXA 具有更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性。見(jiàn)圖6。

圖6 各組結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞的存活率Fig.6 Survival rates of colon cancer CT26 cells in various groups

NVs@OXA組CT26 細(xì)胞凋亡率（34.51%±0.30%）明顯高于游離OXA組（21.69%±0.70%），該結(jié)果與MTT 結(jié)果一致，即NVs@OXA 較游離OXA 夠誘發(fā)更多的結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞發(fā)生凋亡。見(jiàn)圖7。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組結(jié)腸癌CT26 細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of colon cancer CT26 cells detected by flow cytometry

3 討 論

結(jié)直腸癌已成為當(dāng)今世界發(fā)病率第三、死亡率第二的惡性腫瘤。由于結(jié)直腸癌具有易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特性，晚期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后效果不理想?；熓桥R床治療結(jié)直腸癌的主要手段之一，提高化療藥的利用度成為決定臨床治療效果的關(guān)鍵因素。

多項(xiàng)研究［19-22］顯示：基于細(xì)胞膜囊泡的化療藥物遞送系統(tǒng)在多種腫瘤模型中取得了良好的抗腫瘤效果。ZHANG 等［19］采用紅細(xì)胞膜囊泡制備的阿霉素納米藥物均展示出較小分子藥物更強(qiáng)的抑制乳腺癌增殖的效果；COMPARETTI 等［20］采用胰腺癌PANC-1 細(xì)胞膜制備的吉西他濱/紫杉醇共擔(dān)載納米藥物能夠上調(diào)共刺激分子CD80 和CD86 等分子表達(dá)，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)；GAO 等［21］制備的膽管癌細(xì)胞膜納米囊泡可遞送氨甲喋呤激活機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤功效；QIAO 等［22］制備了擔(dān)載阿霉素的人纖維肉瘤HT1080 細(xì)胞膜囊泡，其較游離藥物具有更強(qiáng)的腫瘤組織保留能力，可延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間。本研究中HEK293 細(xì)胞來(lái)源的NVs 具有極佳的生物相容性，用于擔(dān)載OXA 能夠明顯提高藥物的溶解性和利用度，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示出劑量依賴的殺傷效應(yīng)，顯示出細(xì)胞膜納米藥物的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此外，本研究采用人胚腎HEK293 細(xì)胞的細(xì)胞膜制備N(xiāo)Vs，低分化的HEK293 細(xì)胞具有較低的免疫原性，因此有望在將來(lái)作為一種通用的遞送策略用于多種疾病的治療。本研究成功制備了基于細(xì)胞膜囊泡的OXA 納米藥物NVs@OXA，該納米藥物可被結(jié)腸癌CT26細(xì)胞高效內(nèi)吞并具有較游離藥物更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)，顯示出細(xì)胞膜囊泡藥物在結(jié)腸癌方面巨大的的治療潛力，本研究結(jié)果可為開(kāi)發(fā)高效低毒的新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。