實驗性種植體周圍炎羊模型的建立和炎性因子在模型羊齦溝液及牙齦組織中的表達

楊 明, 李含薇, 吳 巍, 宋 洋, 賈 涵, 林百惠, 賴亞輝

（1.北華大學口腔醫(yī)學院口腔內(nèi)科學教研室，吉林 吉林 130013；2.北華大學口腔醫(yī)學院口外頜面外科教研室，吉林 吉林 130013；3.北華大學口腔醫(yī)學院基礎(chǔ)教研室，吉林 吉林 130013；4.北華大學口腔醫(yī)學院修復學教研室，吉林 吉林 130013；5.北華大學預(yù)防醫(yī)學院營養(yǎng)學教研室，吉林 吉林 130013）

種植義齒是臨床常用的牙列缺損修復方式。straumann 官方網(wǎng)站和招商證券網(wǎng)給出的數(shù)據(jù)顯示：2011—2017年我國種植牙年復合增長率高達56%。國人植牙數(shù)從2011年的12萬顆/年增至2017年的200萬顆/年。隨著骨結(jié)合理論的深入進展和義齒種植技術(shù)的發(fā)展，種植技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿绾潍@得和維持種植體長期健康和整體功能。種植體周圍炎作為一種以細菌為主的多致病因素并發(fā)癥已經(jīng)成為影響種植體遠期療效的最主要疾?。?］。研究［2］顯示：種植體周圍炎發(fā)病率為18%～35%，所以臨床上尋找控制和治療種植體周圍炎的方法成為需要迫切解決的問題。種植體周圍炎是與種植體功能喪失相關(guān)的不可逆性炎癥，其特征是軟組織感染和周圍骨質(zhì)喪失，最終導致種植體脫落。實驗動物模型是研究疾病發(fā)病機制的重要工具［3］。目前已經(jīng)通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）注 射法［4］、飼養(yǎng)含菌飼料法［5］和結(jié)扎法［3］建立了實驗性種植體周圍炎模型。種植體周圍炎與牙周炎相似，主要致病因子是菌斑。

白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）和白細胞介素23（interleukin-23，IL-23）作為一對炎癥軸在很多種慢性炎癥疾病的發(fā)病機制中起重要作用［6］，并與其他炎性因子協(xié)同放大炎癥反應(yīng)。環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和白細胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）基因等級在炎癥細胞中明 顯升高［7-8］。研究［9］顯示：種植體周圍炎的炎性因子可以通過協(xié)同作用調(diào)節(jié)免疫細胞、破壞骨組織，導致骨吸收和附著喪失（attachment loss，AL）。目前針對種植體周圍炎的動物模型研究主要集中在犬、小型豬、兔子和鼠等動物，也有研究［10］顯示：在羊脛骨中部植入種植體，探討經(jīng)皮種植體周圍炎的程度與菌群感染的關(guān)系。目前，在口內(nèi)探討種植體周圍炎的羊模型在國內(nèi)尚未見報道。本研究采用即刻種植和結(jié)扎誘導法建立實驗性種植體周圍炎羊模型，探討IL-17、IL-23、COX-2和IL-1α 在實驗性種植體周圍炎模型羊齦溝液和牙齦組織中的表達，闡述其在種植體周圍炎中的致病作用，為種植體周圍炎動物模型的建立提供新的思路和參考，也為臨床治療種植體周圍炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器9只20～24個月綿羊（小尾寒羊），體質(zhì)量約為25 kg，雌雄不限，身體健康，由吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物學院提供，動物合格證號： CPBHUIACUC2017- 005；在實驗期間給羊定時喂嫩草。種植體型號FX4008sw（韓國DIO 公司），牙周探針（深圳市為超貿(mào)易有限公司），IL-17和IL-23 ELISA試劑盒（上海信帆生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（SuperScript Ⅱ，上海西唐生物科技有限公司），Whatman 3#濾紙（深圳威馬森過濾技術(shù)有限公司），氯氨酮注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥）。種植機（韓國DIO），電子分析天平（上海市維菱科學儀器有限公司），0-150 游標卡尺（常州銳品精密儀器有限公司），LN7040 動物高頻X 光機（山東藍鳥醫(yī)學科技發(fā)展有限公司），EOS600D 單反相機（佳能公司）。

1.2 術(shù)前準備通過預(yù)實驗了解綿羊頭骨解剖特點，確定合適的植入種植體的位點，避開較寬大的下頜神經(jīng)管和上頜竇，選擇位置較靠前的上頜雙尖牙區(qū)作為植入位點，并通過術(shù)前X 線了解實驗羊骨量確定植體型號。

1.3 動物分組和動物模型建立實驗前將9只羊隨機分為空白組、對照組和模型組，每組3只，飼養(yǎng)在吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物學院專屬養(yǎng)殖區(qū)，動物管理符合動物保護條例。每組羊手術(shù)之前，采用3% 氯氨酮按1～2 mg·kg－1行肌肉注射麻醉，麻醉起效后將羊用繃帶固定于手術(shù)臺上，取側(cè)臥位，采用繃帶牽引上頜。拔除對照組和模型組右上頜雙尖牙，同期植入植體，旋入基臺，并確定無咬合干擾。軟食喂養(yǎng)，3個月后待植體骨結(jié)合形成后行二期手術(shù)，分離種植體頂端牙齦軟組織，連接基樁，基臺暴露與牙齦之上，采用6 號絲線在基臺頸部捆綁絲線，并采用探針將絲線沿根尖方向壓入齦溝內(nèi)，絲線末端留于口腔內(nèi)促成微生物聚集，誘導炎癥發(fā)生，制成種植體周圍炎動物模型。空白組羊第0天處死，對照組羊3個月后處死，模型組羊結(jié)扎絲線4周后處死，處死前獲取齦溝液，處死后獲取各組羊牙齦組織標本。

1.4 各組羊牙齦組織形態(tài)表現(xiàn)觀察對照組和模型組羊種植體周圍牙齦組織的顏色、形態(tài)、質(zhì)地和滲出情況。診斷種植體周圍炎需進行的主要檢查是探查種植體周圍袋深度（depth of periimplant pocket，PD）、AL 及探診出血情況。采用牙周鈍頭塑料探針檢查種植體PD 和AL 情況。健康的種植體周圍PD≤4 mm，采用較輕的力量（約0.25 N）探診。PD 為種植體周袋底至牙齦邊緣的距離。AL 為種植體周袋底至種植體與基臺連接處的距離。采用牙齦指數(shù)（gingival index，GI）評估探診出血情況。GI 計分標準： 0分為牙齦健康；1分為牙齦輕度炎癥，牙齦顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2分為牙齦有中等炎癥，牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3分為牙齦有嚴重炎癥，牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動出血傾向。

1.5 LN7040 動物高頻X 光機和佳能相機觀察各組羊種植體周圍組織的變化種植體周圍炎是種植體周圍黏膜炎繼續(xù)向深部發(fā)展引起支持骨破壞的一種種植體周圍病，進行X 線檢查主要是通過觀察種植體近中和遠端部位的骨吸收程度。分別在種植體植入后3 和4個月時對對照組和模型組羊進行照相和拍攝X 線片，觀察種植體愈合情況和結(jié)扎絲線后建模情況。

1.6 ELISA 法檢測各組羊齦溝液中IL-17 和IL-23水平采用干棉球擦干牙面或種植基臺表面，分別在空白組羊齦溝內(nèi)、對照組和模型組羊植體的近中、遠中、頰側(cè)和舌側(cè)放置Whatman 3#濾紙條，10min后取出濾紙條，置于EP管中，加 入0.9%NaCl 溶液，離心10 min 取上清液備用。采用ELISA 法檢測各組羊齦溝液中IL-17 和IL-23 水平，根據(jù)說明書按步驟操作。

1.7 實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantificative PCR，RT-qPCR）法檢測各組羊牙齦組織中IL-1α mRNA 表達量將處死后的3組羊獲取上頜骨，切取對照組和模型組羊種植體腭側(cè)牙齦組織，空白組羊切取同一部位的牙齦組織，－80℃條件下儲存。采用SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，按試劑盒說明書操作，將羊牙齦組織剪碎，采用試劑從空白組、對照組和模型組羊牙齦組織中分離出總RNA。cDNA 由2 μg 總RNA 合成，基因特異性的 引 物：IL-1α上游引物5′-CCCAAGCAAGGAAAAGGAAGG-3′，IL-1α 下游引物5′-GACTGAGTCTTCCCCTCGTA3′。DNA聚合酶在95℃、1 min 條件下失活，在不同循環(huán)執(zhí)行中進行擴增，94℃、30 min 變性，退火在引物對應(yīng)的特定溫度下退溫1 min 后，72℃下采用Taq 聚合酶延長2 min。RT-qPCR 產(chǎn)物置于Tris-agarose-EDTA 緩沖液中，采用1%Agarose 凝膠進行電泳，并采用溴化乙基進行分析。

1.8 Werntern blotting 法檢測各組羊牙齦組織中COX-2 蛋白表達量采用保持在冰盒里的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer solution ，PBS）清洗3次剪碎后的羊牙齦組織，加入裂解液進行組織裂解，然后將其置于冰盒中30 min，每10 min 高速震蕩1次。最后4℃、13 200 g 離心10 min，上清液儲存于－80℃冰箱中為實驗分析做準備。準備15～25 mg 上清總蛋白樣品，根據(jù)COX-2 相對分子質(zhì)量，加樣至SDS-PAGE 凝膠，進行跑膠。轉(zhuǎn)膜至甲醇處理過的磷聚偏氟乙烯膜（Millipore）后采用5% 脫脂牛奶將其封閉1 h，洗膜加入COX-2 的一抗過夜，次日加入相應(yīng)的二抗室溫孵育60～90 min。采用ECL 試劑盒對特定的條帶進行檢測。采用磷酸成像器和Quantity one version 軟件進行分析，檢測各組羊牙齦組織中COX-2 蛋白表達量。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組羊齦溝中IL-17 和IL-23 水平進行正態(tài)分布檢驗，均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和模型組羊種植體周圍牙齦組織形態(tài)表現(xiàn)種植體植入后3個月除1枚植體脫落外，其余植體均形成良好骨結(jié)合，未結(jié)扎的對照組羊種植體周圍牙齦組織未見明顯炎癥；結(jié)扎4周后，模型組羊種植體周圍牙齦組織可見充血、水腫、質(zhì)地松軟和滲出，見圖1。2組羊種植體周圍牙周指數(shù)GI 、PD 和AL 見表1。

圖1 2組羊種植體周圍牙齦組織形態(tài)表現(xiàn)Fig.1 Morphology of gingival tissue around implants of sheep in two groups

表1 2組羊種植體周圍牙周指數(shù)Tab.1 Periodontal indexes around implants of sheep in various groups（n=3,±s）

表1 2組羊種植體周圍牙周指數(shù)Tab.1 Periodontal indexes around implants of sheep in various groups（n=3,±s）

*P＜0.05 vs control group.

Group GI PD(l/mm) AL(l/mm)Control 0.65±0.63 2.65±0.22 0.32±0.27 Model 3.26±0.17*5.12±0.59*2.98±0.43*

2.2 對照組和模型組羊種植體周圍骨密度對照組羊種植體周圍牙槽骨無明顯變化；結(jié)扎后4周模型組羊可見明顯牙槽骨吸收，種植體周圍出現(xiàn)陰影。見圖2。

圖2 2組羊種植體周圍骨密度Fig.2 Bone densities around implants of sheep in two groups

2.3 各組羊齦溝液中IL-17 和IL-23 水平與空白組比較，對照組和模型組羊齦溝液中IL-23 水平明顯升高（P＜0.05）；與空白組比較，對照組羊齦溝液中IL-17 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，模型組羊齦溝液中的IL-17 水平明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組羊齦溝液中IL-17 和IL-23 水平Tab.2 Levels of IL-17 and IL-23 in gingival crevicular fluid of sheep in various groups（n=3,±s）

表2 各組羊齦溝液中IL-17 和IL-23 水平Tab.2 Levels of IL-17 and IL-23 in gingival crevicular fluid of sheep in various groups（n=3,±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs control group.

Group Blank Control Model IL-17 [ρB/(μg·L－1)]197.27±56.43 213.24±32.16 651.13±46.21*△IL-23 [ρB/(mg·L－1)]42.71±7.65 57.69±10.39*86.43±5.62*△

2.4 各組羊牙齦組織中IL-1α mRNA 和COX-2 蛋白表達量與空白組和對照組比較，模型組羊牙齦組織中IL-1α mRNA 表達量和COX-2 蛋白表達量明顯升高。見圖3 和4。

圖3 各組羊牙齦組織中IL-1α mRNA 表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of IL-1α mRNA in gingival tissue of sheep in various groups

3 討 論

圖4 各組羊牙齦組織中COX-2 蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of COX-2 protein in gingival tissue of sheep in various groups

目前種植牙是臨床牙列缺損和牙列缺失患者的主要修復方法之一，而種植體周圍炎是種植修復遠期失敗的主要原因之一［11］。深入探討種植體周圍炎的發(fā)病機制和預(yù)防治療方法，合理選擇實驗動物模型至關(guān)重要，本課題組之前已在犬、兔、小型豬和小鼠中成功誘導種植體周圍炎［3］，為了客觀評估治療方法的效果，種植體周圍炎癥造模成功后能夠長期留存口內(nèi)是后續(xù)實驗?zāi)軌蛘ｉ_展的必要條件，這就要求實驗動物必須能夠具有足夠的頜骨骨量［12］。羊是一種能夠提供頜骨充足骨量的大型動物，又具有性格溫順、容易圈養(yǎng)和具有類似人類的自然牙列更換等優(yōu)點［13］。有研究［14-15］對比采用微型接骨鈦板和螺紋釘2種方法治療綿羊頜骨下頜角區(qū)人為造成的骨折，觀察頜骨的愈合情況，結(jié)果證明綿羊頜骨損傷后具有與人類相類似的骨愈合過程。因此羊是理想的實驗動物，本研究建立實驗性種植體周圍炎羊模型，探討種植體周圍炎發(fā)病機制相關(guān)的細胞和炎性因子的變化。本課題組通過預(yù)實驗觀察到綿羊上下頜骨的骨量巨大，尤其是下頜角區(qū)。但由于手術(shù)入路問題和羊下頜神經(jīng)管十分寬大、走行較長且延伸到下頜切牙區(qū)，因此選擇上頜骨中段雙尖牙區(qū)作為手術(shù)植入位點。本研究結(jié)果顯示：上頜骨中段雙尖牙區(qū)域種植成功率較高，實驗過程中僅有1枚種植體脫落，可能是由于羊口腔活動活躍，舌體靈活，導致植體受到過大側(cè)向力導致失敗。

本研究采用療程短、愈合快、保留軟組織能力佳和成功率高的即刻種植方法，這也是目前臨床常用的手術(shù)方法［3］。

本研究結(jié)果顯示：模型組羊牙齦組織有肉眼可見的炎癥改變，在植體骨結(jié)合成功后，選擇絲線結(jié)扎法制作種植體周圍炎模型［16］。該方法能夠在正常口腔環(huán)境下引入齦下菌斑，使種植體周圍大量的致病菌群聚集，逐漸導致炎癥產(chǎn)生，并產(chǎn)生一系列與臨床實際病情相似的癥狀和病理過程，造模前后檢查植體周圍牙周情況并記錄GI、PD 及AL 程度顯示：造模后植體周圍出現(xiàn)類似于牙周炎的臨床表現(xiàn)，從而成功建立實驗性種植體周圍炎羊模型。

研究［17］顯示：發(fā)生牙周炎時，牙周免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)如細胞因子等，對牙周組織損傷的炎癥反應(yīng)具有關(guān)鍵作用。在炎癥早期，病原菌結(jié)合樹突狀細胞和巨噬細胞上的Toll 樣受體（Tolllike receptor，TLR），促使機體中IL-23 大量產(chǎn)生；IL-23 不僅可以促進CD4+T淋巴細胞的增殖而使抗原提呈細胞和T 淋巴細胞產(chǎn)生干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12，還能調(diào)節(jié)樹突狀細胞的共刺激功能，并且IL-23 具有前炎性因子的作用而促進炎癥反應(yīng)。并與TLR 配體、IL-1β 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等協(xié)同放大炎癥反應(yīng)。本文作者于不同時期收集齦溝液，采用ELASA 法檢測齦溝液中IL-17 和IL-23水平的結(jié)果顯示：與空白組和對照組比較，模型組羊齦溝液中IL-17 和IL-23 表達水平升高，表明IL-23 和IL-17 均是重要的炎性因子，促進種植體周圍炎的進展，介導與種植體周圍炎相關(guān)的骨質(zhì)破壞。IL-23/IL-17 炎 癥軸在許多研究［18-20］中被認為是準確反映牙周組織免疫炎癥狀態(tài)的檢測指標。IL-17是由IL-23與轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL共同作用于Th0細胞向Th17 細胞方向分化時分泌產(chǎn)生的，IL-17 作為Th17 細胞的主要細胞因子及前炎癥性因子，能促進先天性免疫細胞（如中性粒細胞）的成熟和聚集［21］。革蘭陰性菌細胞外壁中含有LPS，當菌體死亡或者菌體崩解時可以釋放LPS，LPS 可以刺激單核細胞分泌出炎癥介質(zhì)，其中包括COX，COX-2是COX 家族的一員，當細胞受到炎癥刺激時，炎癥細胞中COX-2 水平會明顯升高。研究［22］顯示：IL-1 也被證明是牙齦炎組織中炎癥性因子。本研究結(jié)果顯示：與空白組和對照組比較，模型組羊牙齦組織中IL-1α 基因等級和COX-2 蛋白表達水平明顯升高。模型羊牙齦組織中IL-1α 和COX-2 高表達可能對種植體周圍炎的發(fā)病具有促進作用。本研究結(jié)果為今后的種植體周圍炎治療提供一定的參考依據(jù)。

本研究成功建立了實驗性種植體周圍炎羊模型，種植體可以在羊的頜骨內(nèi)完成類似人體內(nèi)的骨結(jié)合，但應(yīng)注意避免側(cè)向力的影響。本研究驗證了IL-17、IL-23、IL-1α 和COX-2 等炎性因子在實驗性種植體周圍炎羊模型齦溝液中和牙齦組織中高表達，為揭示種植體周圍炎的發(fā)病機制提供了參考，為種植體周圍炎預(yù)防和治療的研究提供實驗基礎(chǔ)。