棕櫚酸對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積的誘導(dǎo)作用

何 勇, 洪 莉, 黃國(guó)濤, 趙芷涵

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430060）

女性盆底功能障礙（pelvic floor dysfunction，PFD）是指與盆底肌等盆底支持組織功能異常有關(guān)的疾病，臨床表現(xiàn)多樣，主要為尿失禁、盆腔器官脫垂和性功能障礙等［1］。雖然這些臨床癥狀不會(huì)威脅患者的生命，但給患者帶來(lái)了巨大的心理負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的日常生活和身心健康。不同地區(qū)人群中PFD 患病率存在差異。HALLOCK 等［2］研究顯示： 美國(guó)女性PFD 的患病率約為23.7%，80歲及以上女性患病率增加1 倍以上，所有患者中接受治療者不足20%。我國(guó)女性PFD 患病率達(dá)20%～40%，不同年齡段PFD 患者數(shù)存在一定差異，隨著人口老年化的加劇，女性PFD 患者數(shù)量明顯增加［3-5］。

PFD 的病因尚未完全清楚，目前認(rèn)為其是一種多因素共同引發(fā)的疾病，如年齡、妊娠、肥胖和盆腔手術(shù)史等［6-7］。其中，肥胖損傷盆底功能包括盆底肌肉組織損傷、腹腔內(nèi)壓力升高、神經(jīng)損傷和相關(guān)的傳導(dǎo)異常以及與肥胖有關(guān)的并發(fā)癥［8］，但肥胖所致PFD 機(jī)制尚未完全清楚。國(guó)內(nèi)外關(guān)于肥胖對(duì)盆底肌肉支持組織影響的研究較少，缺乏合適有效的肥胖相關(guān)的骨骼肌細(xì)胞。本研究以小鼠骨骼肌C2C12 成肌細(xì)胞為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)棕櫚酸（palmitic acid，PA）對(duì)骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積的誘導(dǎo)效果，探討PA 體外構(gòu)建骨骼肌高脂細(xì)胞的作用及其意義，旨在為研究肥胖女性壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）的病理生理及其他肥胖相關(guān)肌肉疾病的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠C2C12 成肌細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司。CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Molecular Technologie 公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平檢測(cè)試劑盒、油紅O 染色液（細(xì)胞專用）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PA 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司，正置顯微鏡和倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.2 含不同濃度PA 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基配制將PA 在55℃水浴加熱下完全溶解于體積比為75% 的乙醇中，然后將PA 稀釋于含1% DMEM（不含脂肪酸）的BSA 中，分別配制含終濃度為50、75、100和125 μmol·L－1PA 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，加入0.375%乙醇，將溶液輕搖混合2 h，然后通過(guò)0.2 μm 過(guò)濾器除菌。無(wú)脂肪酸對(duì)照組培養(yǎng)基中僅添加1% BSA和0.375% 乙醇［9-10］。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)各組C2C12 成肌細(xì)胞增殖活性將C2C12 成肌細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6 孔板，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)貼壁約24h后，分別采用含50、75、100 和125 μmol·L－1PA 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基處理24h作為不同濃度PA組，對(duì)照組培養(yǎng)基不含PA，其他與PA組相同。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化離心，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至4×106mL－1，取100 μL 接種于96 孔板，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁30 min，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8 試劑的100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔于450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，以A 值代表細(xì)胞增殖活性。

1.4 各組C2C12 成肌細(xì)胞中脂質(zhì)沉積水平檢測(cè)TG 水平檢測(cè)：將經(jīng)PA 處理過(guò)的C2C12 成肌細(xì)胞消化離心、計(jì)數(shù)，PBS 緩沖液洗滌2～3次，按照TG 檢測(cè)試劑盒步驟提取細(xì)胞中TG，在420 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A 值，計(jì)算細(xì)胞中TG 水平。TG 水平（mg/106cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（測(cè)試孔A 值－空白孔A 值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔A 值－空白孔A 值）/細(xì)胞密度=（測(cè)試孔A 值－空白孔A 值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔A 值－空白孔A 值）/細(xì)胞密度。C 標(biāo)準(zhǔn)品為1 g·L－1，細(xì)胞密度為1×106mL－1。油紅O 染色：將細(xì)胞平鋪于玻片上，采用PA 處理后，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，采用PBS 洗滌2次，加入ORO 固定液固定20～30 min；棄去固定液，采用蒸餾水洗滌2次；加入60% 異丙醇浸洗5 min，棄去60% 異丙醇后加入新配制好的ORO 染色液，浸染10～20 min；棄去染色液，水洗2 ～5次，直到無(wú)多余染液。加入Mayer 蘇木素染色液，復(fù)染核1～2 min，棄去染液后水洗2～5次。加入ORO 緩沖液反應(yīng)1 min，棄去緩沖液，加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并置于顯微鏡下觀察。采用Image J 軟件對(duì)TG 水平進(jìn)行定量分析。

1.5 倒置顯微鏡下觀察各組C2C12 成肌細(xì)胞的分化狀態(tài)將細(xì)胞均勻接種于6 孔板，經(jīng)PA 處理48 h，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90% 時(shí)采用含2% 馬血清的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，分別在分化的第1、3和7天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的分化狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞中TG 水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組C2C12 細(xì)胞增殖活性分別采用含50、75、100 和125 μmol·L－1PA的生長(zhǎng)培養(yǎng)基處理C2C12 細(xì)胞24h后，CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，50、75 和100 μmol·L－1組C2C12 細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），125 μmol·L－1PA組C2C12 細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組C2C12 細(xì)胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of C2C12 cells in various groups

2.2 不同濃度PA 處理48h后各組C2C12 細(xì)胞中TG 水平由于125 μmol·L－1PA 對(duì)細(xì)胞損傷明顯，因此采用50、75 和100 μmol·L－1PA 進(jìn)一步 探討PA 對(duì)C2C12 細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用。不同濃度PA處 理48h后，與對(duì)照組比較，50 、75 和100 μ mol·L－1PA組細(xì)胞中TG 水平升高（P＜0.01），100 μmol·L－1PA組細(xì)胞中TG 水平升高最明顯。與50和75 μmol·L－1組比較，100 μmol·L－1PA組C2C12 細(xì)胞中TG 水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度PA 處理48h后各組C2C12 細(xì)胞中TG 水平Tab.1 TG levels in C2C12 cells in various groups after treated with different concentrations of PA for 48 h（n=5，x±s，m/mg）

2.3 100 μmol·L－1 PA 處理不同時(shí)間后各組C2C12細(xì)胞中TG 水平采用100 μmol·L－1PA分別處理細(xì)胞24、48 和72 h，探討不同處理時(shí)間對(duì)C2C12細(xì)胞中TG 水平影響，結(jié)果顯示：分別培養(yǎng)24、48和72h后，C2C12 細(xì)胞中TG 水平較對(duì)照組（培養(yǎng)0 h）明顯升高（P＜0.01），培養(yǎng)48 和72 h組細(xì)胞中TG 水平組比培養(yǎng)24 h組升高（P＜0.05）。PA培養(yǎng)72 h組細(xì)胞中TG 水平雖比培養(yǎng)48h稍有升高，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 100 μmol·L-1PA 處理不同時(shí)間后各組C2C12細(xì)胞中TG 水平Tab.2 TG level in C2C12 cells in various groups after treated with 100 μmol·L－1PA for different time（n=5，x±s，m/mg）

為了進(jìn)一步驗(yàn)證100 μmol·L－1PA 作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)沉積的效果，采用油紅O 染色對(duì)細(xì)胞中TG 進(jìn)行染色觀察的結(jié)果顯示：對(duì)照組（0 h組）細(xì)胞中很少見到紅色脂滴，培養(yǎng)24、48 和72 h組細(xì)胞質(zhì)中可見大量紅色脂滴（圖2）。Image J 軟件定量分析結(jié)果顯示出與TG 水平變化趨勢(shì)相同的結(jié)果（圖3）。

圖2 各組C2C12 細(xì)胞中TG 沉積形態(tài)表現(xiàn)（油紅O，×200）Fig.2 Morphology of TG deposition in C2C12 cells in various groups(Oil Red O,×200)

圖3 100 μmol·L－1PA 處理不同時(shí)間后C2C12 細(xì)胞中TG 水平Fig.3 TG levels in C2C12 cells in various groups after treated with 100 μmol·L－1PA for different time

2.4 各組C2C12 細(xì)胞分化狀態(tài)為了進(jìn)一步評(píng)估高脂處理后的C2C12 細(xì)胞生物特性是否改變，采用含2% 馬血清的分化培養(yǎng)基處理細(xì)胞，在分化處理后第3天和第7天顯微鏡下觀察細(xì)胞中肌管形成情況。PA 作用后的第3天，PA組和對(duì)照組C2C12細(xì)胞中均有較少的小肌管形成，在PA 處理后的第7天，PA組和對(duì)照組C2C12 細(xì)胞中均有較多的肌管形成，但對(duì)照組有更多的大肌管形成。見圖4。

圖4 100 μmol·L－1PA 處理后各組C2C12 細(xì)胞分化情況(Bar=100 μm)Fig.4 Differentiation of C2C12 cells in various groups after treated with 100 μmol·L－1PA(Bar=100 μm)

3 討 論

WHO 關(guān)于肥胖的定義是體質(zhì)量指數(shù)大于或等于30 kg·m－2，截至2016年，18歲及以上的成年人中有39%（男性39%，女性40%）超重，肥胖人群占13%。ZHU［11］等對(duì)北京5 300名女性進(jìn)行的尿失禁橫斷面研究顯示：肥胖是女性所有類型尿失禁的重要危險(xiǎn)因素。另有研究［12］表明：成年女性中肥胖人群PFD 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高于非肥胖女性，通過(guò)手術(shù)或非手術(shù)方法減輕體質(zhì)量可有效改善PFD相關(guān)癥狀并提高PFD 疾病相關(guān)手術(shù)治療的療效［12］?？梢姺逝衷谂訮FD 發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對(duì)女性健康造成巨大威脅。目前研究者［13］普遍認(rèn)為：肥胖導(dǎo)致PFD 是由于腹內(nèi)壓增加，從而導(dǎo)致盆底肌肉和筋膜等支持組織和神經(jīng)支配減弱所致。

肥胖患者血液中游離脂肪酸的濃度明顯升高，包括飽和脂肪酸（如硬脂酸和PA）和不飽和脂肪酸（油酸和亞油酸）［14-15］。代謝紊亂和攝入大量飽和脂肪酸（尤其是PA）會(huì)增加游離脂肪酸在血液中的濃度，影響機(jī)體正常生理功能，引發(fā)多種疾病和病理改變，如PFD、炎癥反應(yīng)和糖尿病等，這是肥胖相關(guān)疾病發(fā)展的一個(gè)重要因素［8，16-18］。PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的作用已經(jīng)得到研究［19-21］證實(shí)，同時(shí)也被廣泛用于誘導(dǎo)多種細(xì)胞和組織的胰島素抵抗及損傷模型，包括骨骼肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞。但多數(shù)肥胖人群并未發(fā)生胰島素抵抗和明顯的細(xì)胞損傷，細(xì)胞雖處于高脂內(nèi)環(huán)境但仍具有較好的生理功能，研究此時(shí)的細(xì)胞代謝和基因表達(dá)改變，從而尋找早期預(yù)防干預(yù)措施也顯得尤為重要。本研究采用PA 處理小鼠C2C12 細(xì)胞，盡可能地避免損傷細(xì)胞，同時(shí)最大限度促進(jìn)了細(xì)胞中脂質(zhì)沉積，構(gòu)建了一種穩(wěn)定可靠的誘導(dǎo)體外骨骼肌細(xì)脂質(zhì)沉積的方法，這與大部分肥胖人群體內(nèi)游離脂肪酸中PA 升高而處于健康或亞健康狀態(tài)的變化一致。

已有研究［22］顯示：肥胖可導(dǎo)致骨骼肌自噬功能失調(diào)，過(guò)度自噬導(dǎo)致肌肉萎縮，肌肉強(qiáng)度和肌纖維橫截面積降低。MESSAOUDI 等［23］對(duì)6只 恒 河猴的研究顯示：高脂飲食致使骨骼肌轉(zhuǎn)錄組重編程，纖維化和促炎基因的表達(dá)增加，代謝相關(guān)基因的表達(dá)減少，即使在熱量攝入限制逆轉(zhuǎn)肥胖后，骨骼肌轉(zhuǎn)錄異常仍然存在。但目前的研究多數(shù)在動(dòng)物層面進(jìn)行，骨骼肌細(xì)胞層面了解甚少，且缺乏統(tǒng)一有效的高脂細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用PA 誘導(dǎo)骨骼肌高脂狀態(tài)，TG 定量和染色結(jié)果證實(shí)了其有效性，2% 馬血清分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)PA 處理的C2C12細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞分化能力稍有減弱，但仍有較高的分化形成肌管的潛能，說(shuō)明PA 培養(yǎng)保留了細(xì)胞的生理特性，可應(yīng)用于肥胖有關(guān)的成肌細(xì)胞增殖分化等方向的研究。這與研究［24-26］所報(bào)道的肥胖小鼠骨骼肌損傷后仍具有一定的再生能力的結(jié)論一致。

本研究采用PA 體外誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積的結(jié)果顯示：100 μmol·L－1PA 具有穩(wěn)定有效的作用，對(duì)細(xì)胞的增殖活性和分化評(píng)估表明其在骨骼肌形成，即增殖和分化方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可能作為體外研究骨骼肌高脂狀態(tài)的細(xì)胞模型，并為研究肥胖女性盆底肌生理生化改變提供細(xì)胞基礎(chǔ)，有助于進(jìn)一步明確肥胖患者PFD 的發(fā)病機(jī)制，推動(dòng)目前對(duì)肥胖相關(guān)PFD 的研究進(jìn)程，同時(shí)為其他肥胖相關(guān)的肌肉疾病的研究提供理論依據(jù)。