miR-34a 對(duì)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用及其機(jī)制

董 霞, 王訓(xùn)霞, 楊 芳

（1.山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)口腔科，山東 青島 266000；2.山東省青島市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，山東 青島 266000）

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一種具有與其他干細(xì)胞相似的具有自我更新和克隆形成特性的成體干細(xì)胞，在一定條件下具有成骨、神經(jīng)和脂肪等多方向分化的能力［1］。研究［2］顯示： PDLSCs不僅具有再生和修復(fù)牙槽骨組織的能力，而且還具有調(diào)節(jié)牙周組織分化和免疫調(diào)節(jié)的能力，是牙周組織再生和骨質(zhì)缺損修復(fù)的重要種子細(xì)胞。然而PDLSCs 的成骨分化不僅受多種炎性因子的影響，還受內(nèi)部錯(cuò)綜復(fù)雜信號(hào)通路的調(diào)控。微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）作為一種小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后mRNA水平表達(dá)調(diào)控。研究［3-4］顯示： 抑制miR-34a 可增強(qiáng)人類脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)成脂和成骨分化潛能。miR-34a 可能通過(guò)MAPK 途徑調(diào)節(jié)PDLSCs 的成骨分化過(guò)程。上述研究提示：miR-34a 參與調(diào)控PDLSCs 的成骨分化，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未證實(shí)。解整合素金屬蛋白酶10（a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10）是一種Notch 信號(hào)通路最關(guān)鍵的限速酶，能夠介導(dǎo)膜外段Notch 水解促進(jìn)Notch 信號(hào)通路的活化，進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞的分化潛能［5-6］。研究［7］顯示：Notch信號(hào)通路在PDLSCs 的成骨過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但miR-34a 是否通過(guò)Notch 信號(hào)通路調(diào)控PDLSCs 成骨分化尚不清楚。本研究探討miR-34a 是否通過(guò)靶向調(diào)控ADAM10 表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)Notch 信號(hào)通路影響PDLSCs 成骨分化。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、主要試劑和儀器miR-34a 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pMSCV-miR-34a）及其陰性對(duì)照空載質(zhì)粒（pMSCV-vector）的構(gòu)建及其慢病毒的包裝、濃縮、純化以及慢病毒滴度（2×108TU·mL－1）測(cè)定均由吉滿生物科技（上海）有限公司完成；miRNA-34a 模擬物（miR-34a mimics）和陰性對(duì)照miRNA（miRNA NC）由上海吉瑪公司合成。α -MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公 司，熒光抗體FITCCD90、APC-CD105、APC-CD34 和PE-CD45 購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和綠色熒光定量試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa 公司，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒（PNP 比色法）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司，Notch1 抗體、Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD）、Hes 家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1（Hes family bHLH transcription factor 1，Hes1）抗體、ADAM10 抗體和GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，茜素紅染液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。Dual-Luciferase?Reporter System購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，全自動(dòng)凝膠成像分析儀購(gòu)自上海天能公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek 公司。

1.2 PDLSCs 的分離和鑒定收集山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)口腔科18～24歲患者因正畸而拔除且健康完整的前磨牙或第三磨牙，無(wú)菌條件下分離牙周膜組織并采用含2% 雙抗（鏈霉素/青霉素）的PBS緩沖液清洗干凈，剪碎，加入0.5% Ⅰ型膠原酶消化45 min，然后1 500 r·min－1離心5 min，棄上清，加入含10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液重懸，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液1次，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出并長(zhǎng)至80% 融合率時(shí)，采用有限稀釋法挑選單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。取第3代分離得到的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物CD90、CD105 和造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34 及CD45 的表達(dá)來(lái)鑒定PDLSCs。本研究經(jīng)山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞感染取第3代PDLSCs，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪板量達(dá)到約70% 時(shí)，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（不經(jīng)任何處理）、空載組（感染空載慢病毒）和miR-34a 過(guò)表達(dá)組（感染miR-34a 過(guò)表達(dá)慢病毒）。按照病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為50∶1分別加入miR-34a 過(guò)表達(dá)慢病毒及其陰性對(duì)照空載慢病毒，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，更換新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。感染48h后采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)株，并采用RT-qPCR法檢測(cè)各組PDLSCs中miR-34a表達(dá)水平。

1.4 成骨誘導(dǎo)分化取第3代PDLSCs 或經(jīng)慢病毒感染的PDLSCs，以5×104mL－1的密度接種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用α-MEM 培養(yǎng)液將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至70% 融合率時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液、10 mmol·L－1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L－1維生素C和10 nmol·L－1地塞米松）進(jìn)行培養(yǎng)，每3d換液1次，按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-34a、ALP、Runx2 和OCN mRNA 表達(dá)水平取成骨誘導(dǎo)分化的或經(jīng)慢病毒感染后的PDLSCs，根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書，提取總RNA，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板鏈，采用RT-qPCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。miR-34a 引物序列：Forward 5′-AGGGTGGCAGTGTCTTAGC-3′，Reverse 5′-GAGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 引物序列： Forward 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，Reverse 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；ALP 引 物 序列：Forward 5′-ACTGGTACTCAGACAACGAGAT-3′，Reverse 5′-ACGTCAATGTCCCTGATGTTATG-3′；Runx2 引物序列： Forward 5′-TGGTTACTGTCATGGCGGGTA-3′，Reverse 5′-TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA-3′；OCN 引 物序 列： Forward 5′-AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG-3′，Reverse 5′-CCCTCCTGCTTGGACACAAAG-3′；GAPDH 引物序列： Forward 5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTGG-3′，Reverse 5′-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3′。反 應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算各組PDLSCs 中miR-34a、ALP、Runx2 和OCN mRNA表達(dá)水平。

1.6 Western blotting法檢測(cè)各組PDLSCs 中Notch1、ADAM10、Hes1 和NICD蛋白表達(dá)水平取成骨誘導(dǎo)分化的或慢病毒感染后的PDLSCs，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液進(jìn)行裂解30 min，12 000 r·min－1離心25 min，取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg 總蛋白煮沸變性后，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉45 min 后，TBST 洗滌3次，分別加 入 一 抗Notch1（ 1 ∶1 000 ）、ADAM10（ 1 ∶500）、Hes1（1∶500）、NICD（1∶2 000）和GAPDH（1∶1 000），置于4℃中孵育過(guò)夜。TBST 洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG 二抗體，室溫孵育1 h，采用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影曝光，采用Image J 軟件檢測(cè)各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 茜素紅染色檢測(cè)各組PDLSCs 礦化結(jié)節(jié)情況各組慢病毒感染的PDLSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)21 d后，采用PBS 緩沖液洗滌3次，再采用4% 多聚甲醛將細(xì)胞固定30 min，PBS 緩沖液洗滌3次，滴加適量茜素紅染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色5 min，PBS 緩沖液清洗掉染液后，將細(xì)胞置于倒置顯微鏡上觀察礦化結(jié)節(jié)情況，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)定量分析。礦化結(jié)節(jié)形成量＝礦化結(jié)節(jié)形成面積/細(xì)胞面積×100%。

1.8 各組PDLSCs 中ALP 活性檢測(cè)各組慢病毒感染的PDLSCs 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14 d 后，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞 沉 淀并裂解細(xì)胞，1 500 r·min－1離心15 min，取上清。根據(jù)ALP 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，加入顯色底物并充分混勻，37℃孵育10 min，終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀在405 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度（A）值，以A 值表示各組PDLSCs 中ALP 活性。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-34a 與ADAM10 基因的靶向關(guān)系采用靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan 7.1 對(duì)miR-34a 與ADAM10 基因結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建野生型（WT）和突變型（Mut）ADAM10 3′-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并與miR-34a mimics 和miR-34a NC 共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì) 胞中。共培養(yǎng)48h后，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性表示相對(duì)熒光素酶活性（R/F）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD105、CD34 和CD45 陽(yáng)性表達(dá)率，各組PDLSCs中miR-34a、ALP、Runx2 和OCN mRNA 表達(dá)水平，各組PDLSCs 中Notch1、ADAM10、Hes1 和NICD 蛋白表達(dá)水平，相對(duì)熒光素酶活性，細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成量以及細(xì)胞中ALP 活性等均呈正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PDLSCs 的鑒定流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：分離所得細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90 和CD105 呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為（94.24±1.11）%和（92.09±2.17）%，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34 和CD45 呈陰性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為（0.51±0.07）% 和（1.22±0.19）%。見(jiàn)圖1。

圖1 PDLSCs 的鑒定Fig.1 Identification of PDLSCs

2.2 各組PDLSCs 中miR-34a、ALP、Runx2 和OCN mRNA 及ADAM10 蛋白表達(dá)水平成骨誘導(dǎo)分化第0、7 和14天檢測(cè)結(jié)果顯示：與第0天比較，PDLSCs 中miR-34a 以及成骨標(biāo)志物ALP、Runx2和OCN mRNA 表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與成骨誘導(dǎo)第0天比較，成骨誘導(dǎo)分化第7 和14天后，PDLSCs 中ADAM10 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與成骨誘導(dǎo)第7天比較，成骨誘導(dǎo)第14天PDLSCs 中ADAM10 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 各組PDLSCs 中miR-34a、ALP、Runx2 和OCN mRNA 表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of miR-34a, ALP, Runx2,and OCN mRNA in PDLSCs in various groups

圖3 各組PDLSCs 中ADAM10 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.3 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expression levels of ADAM10 protein in PDLSCs in various groups

2.3 miR-34a 與ADAM10 基因的靶向調(diào)控關(guān)系

RT-qPCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和空載組比較，miR-34a過(guò)表達(dá)組PDLSCs中miR-34a表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan分析結(jié)果顯示： miR-34a 與ADAM10 基因存在靶向互補(bǔ)序列。見(jiàn)圖5A。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示：與miR-34 NC組比較，miR-34a mimics組野生型（ADAM10-Wt）ADAM10 3′-UTR 報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），但miR-34a mimics組突變型（ADAM10-Mut）ADAM10 3′-UTR 報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖5B。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和空載組比較，miR-34a 過(guò)表達(dá)組PDLSCs 中ADAM10 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn) 圖5C 和5D。

圖4 各組PDLSCs 中miR-34a mRNA 表達(dá)水平Fig.4 Expression level of miR-34a in PDLSCs in vari?ous groups

圖5 miR-34a 與ADAM10 基因表達(dá)的關(guān)系Fig.5 Relationship between miR-34a and ADAM10 gene expression

2.4 各組PDLSCs中ALP活性和ALP、Runx2 及OCN mRNA 表達(dá)水平茜素紅染色結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和空載組比較，miR-34a 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)形成量明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖6 和7。與空白對(duì)照組和空載組比較，miR-34a 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中ALP 活性和ALP、Runx2 及OCN mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖8 和9。

圖6 各組PDLSCs 中礦化結(jié)節(jié)形成情況（茜素紅，×100）Fig.6 Formation of mineralized nodules in PDLSCs in various groups(Alizarin red, ×100）

圖8 各組PDLSCs 中ALP 活性Fig.8 ALP activities in PDLSCs in various groups

2.5 各組PDLSCs 中Notch1、NICD 和Hes1蛋白表達(dá)水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)14 d 后，與空白對(duì)照組和空載組比較，miR-34a過(guò)表達(dá)組PDLSCs 中Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖10。

圖10 各組PDLSCs 中Notch1、NICD 和Hes1 蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.10 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of Notch1, NICD, and Hes1 proteins in PDLSCs in various groups

3 討 論

牙周膜是一種薄的非礦化結(jié)締組織，具有成骨細(xì)胞樣特征。PDLSCs 存在于牙周韌帶中，參與牙周組織的再生［8］。自從2004年首次報(bào)道PDLSCs以來(lái)，近年來(lái)學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究［9］。到目前為止，PDLSCs 的性質(zhì)、微環(huán)境對(duì)PDLSCs 的影響以及調(diào)節(jié)其功能的機(jī)制尚不清楚。干細(xì)胞在再生治療中的應(yīng)用迅速發(fā)展，促進(jìn)了對(duì)成體干細(xì)胞的研究。由于PDLSCs 具有先天性的成骨分化能力，因此研究PDLSCs 成骨分化過(guò)程中的特殊調(diào)控因素，將有助于PDLSCs 在臨床治療和生物學(xué)研究中的應(yīng)用。

圖7 各組PDLSCs 中礦化結(jié)節(jié)形成量Fig.7 Formation amounts of calcified nodules in PDLSCs in various groups

圖9 各組PDLSCs 中ALP、Runx2 和OCN mRNA 表達(dá)水平Fig.9 Expression levels of ALP, Runx2, and OCN mRNA in PDLSCs in various groups

miRNAs 是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的小非編碼RNA。特異性miRNAs 在發(fā)育過(guò)程中影響細(xì)胞周期、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等［10］。研究［11-12］顯示：miR-34a 的缺失擴(kuò)大了小鼠多功能干細(xì)胞的發(fā)育潛能，說(shuō)明miR-34a 參與調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的分化能力。青蒿琥酯誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-34a 高表達(dá)，通過(guò)miR-34a/DKK1/Wnt 途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。另外，miR-34a 還與lncRNA 形成競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性關(guān)系介導(dǎo)腫瘤相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［13］，說(shuō)明miR-34a 通過(guò)不同的形式影響各類干細(xì)胞的分化和細(xì)胞行為。本研究結(jié)果顯示：在PDLSCs 成骨誘導(dǎo)過(guò)程中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中miR-34a 表達(dá)水平逐漸上調(diào)，且呈時(shí)間-劑量趨勢(shì)，說(shuō)明miR-34a 參與了PDLSCs的成骨分化。本研究結(jié)果顯示：隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，PDLSCs 中ADAM10 的表達(dá)水平逐漸下調(diào)，這與研究［14］報(bào)道的ADAM10 參與肌肉干細(xì)胞分化的結(jié)論一致。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示：miR-34a 能靶向調(diào)控ADAM10 的表達(dá)，并且miR-34a 過(guò)表達(dá)可降低PDLSCs 中ADAM10 蛋白表達(dá)水平。同時(shí)也有研究［15］顯示：ADAM10 是miR-34a的靶基因，能被miR-34a靶向負(fù)調(diào)控，且ADAM10 過(guò)表達(dá)能逆轉(zhuǎn)miR-34a 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。雖然miR-34a和ADAM10 均參與PDLSCs 的成骨分化，且miR-34a 能靶向抑制ADAM10 表達(dá)，但其具體調(diào)控通路尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示： ALP 活性和茜素紅染色以及成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平一致，表明miR-34a 過(guò)表達(dá)能明顯促進(jìn)PDLSCs 成骨分化程度。結(jié)合miR-34a 與ADAM10 的靶向關(guān)系，可知miR-34a 通過(guò)靶向下調(diào)ADAM10 促進(jìn)PDLSCs 成骨分化。這與miR-34a 過(guò)表達(dá)可抑制牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cell，PDLCs）體外成骨分化能力［16］不一致?？赡茉蚴荘DLSCs 與PDLCs 在生物學(xué)特性和功能方面存在較大差異［17］，且作為牙周組織再生的種子細(xì)胞，PDLSCs 成骨能力遠(yuǎn)強(qiáng)于PDLCs。因此miR-34a 對(duì)兩者的成骨分化作用不同。Notch 信號(hào)通路能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的分化和發(fā)育，由Notch 受體、配體、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CSL 以及其他效應(yīng)物組成。Notch1 是哺乳動(dòng)物中表達(dá)的4種Notch 受體之一，在Notch 信號(hào)的激活過(guò)程中，Notch1 受體與配體相互作用后，NICD 與DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CSL 異源二聚體形成核轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并誘導(dǎo)下游靶基因如HES 和HEY 等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究［18］顯示： 抑制Notch信號(hào)通路可促進(jìn)PDLSCs體外成骨分化。但也有研究［19-20］顯示：激活Notch 信號(hào)通路能促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。兩者存在差異的原因可能是由于在不同個(gè)體或同一個(gè)體不同細(xì)胞中，Notch 受體表達(dá)存在差異，其表達(dá)也會(huì)因個(gè)體和種屬差異而有所不同。ADAM10 是Notch 信號(hào)通路的關(guān)鍵限速酶，在多種細(xì)胞Notch信號(hào)通路可以影響細(xì)胞行為。因此，本文作者推測(cè)ADAM10 極有可能通過(guò)影響Notch 信號(hào)通路來(lái)干預(yù)PDLSCs 的成骨分化。因此本研究對(duì)Notch 信號(hào)通路相關(guān)蛋白Notch1、NICD 和Hes1 等蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示miR-34a 過(guò)表達(dá)可明顯抑制Notch1、NICD 和Hes1 等蛋白表達(dá)，初步說(shuō)明miR-34a 可能通過(guò)靶向下調(diào)ADAM10 抑制Notch 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)PDLSCs 的成骨分化能力。

綜上所述，miR-34a 過(guò)表達(dá)靶向下調(diào)ADAM10，通過(guò)抑制Notch 信號(hào)通路促進(jìn)PDLSCs成骨分化，本研究為PDLSCs 在臨床上的骨再生治療提供了依據(jù)。