blaKPC耐藥基因在肺炎克雷伯菌中的傳播機(jī)制研究

賈阿韶 綜述 余廣超 審校

暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，廣東 廣州 510630

KPC型碳青霉烯酶作為A類碳青霉烯酶中最常見的一種酶類，能夠水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物[1]。blaKPC基因是KPC型碳青霉烯酶的編碼基因，blaKPC基因的傳播可以通過不同的分子機(jī)制來介導(dǎo)，通過可移動(dòng)遺傳元件(如質(zhì)粒等)介導(dǎo)是其中很常見的一種傳播機(jī)制，亦可由染色體介導(dǎo)或克隆等方式進(jìn)行傳播[2]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，耐碳青酶烯肺炎克雷伯菌(CRKP)所導(dǎo)致的血流感染發(fā)生率和死亡率均呈上升趨勢[3-4]。因此，從基因水平研究產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的傳播機(jī)制對(duì)于控制和延緩細(xì)菌耐藥性的傳播具有重要意義。本文主要就blaKPC基因通過可移動(dòng)遺傳元件進(jìn)行傳播的相關(guān)研究做一綜述。

1 質(zhì)粒介導(dǎo)的blaKPC耐藥基因傳播機(jī)制

質(zhì)粒是一種存在于染色體以外的核酸分子，具有自我復(fù)制以及在細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的特征。質(zhì)粒本身攜帶有一些特殊基因，可用于表達(dá)特定的功能，包括耐藥基因、毒力基因等，雖然這些基因?qū)τ诩?xì)菌的生存不是必要的，但其存在對(duì)于細(xì)菌適應(yīng)生存環(huán)境的改變往往有所裨益[5-6]。耐藥基因通過質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播較之染色體更具有靈活性，傳播速度也更快，這一特性使得攜帶KPC耐藥基因的質(zhì)粒更容易造成在腸桿菌科細(xì)菌間的水平傳播，從而導(dǎo)致了產(chǎn)酶菌株的快速播散[7-8]。

質(zhì)粒上存在各種抗菌藥物的抗性基因，即耐藥基因，這些耐藥基因的積累是由于在多種抗菌藥物的選擇壓力下各種復(fù)雜的移動(dòng)元件水平轉(zhuǎn)移事件導(dǎo)致的[9]。質(zhì)粒作為介導(dǎo)耐藥基因進(jìn)行傳播的一種媒介，其傳播方式是多樣的，通過質(zhì)粒接合作用介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播是其中最常見的一種方式，接合作用可以使得耐藥質(zhì)粒從耐藥菌株成功轉(zhuǎn)移至敏感菌株，這種轉(zhuǎn)移方式不僅可以造成耐藥基因在同種菌株間的快速播散，甚至可以造成不同種屬間的快速播散[10-11]。質(zhì)粒分子量大小不同，通過估算質(zhì)粒的分子量大小，有助于研究耐藥性質(zhì)粒的傳播及其進(jìn)化的過程。肺炎克雷伯菌中KPC酶基因位于不同大小的質(zhì)粒上，攜有耐藥基因的質(zhì)粒可以從數(shù)十kb到數(shù)百kb不等，故此可以推斷質(zhì)粒在介導(dǎo)耐藥基因進(jìn)行水平傳播的過程中很有可能出現(xiàn)了重組事件或插入事件，這種可能的存在導(dǎo)致質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移可以從外界獲得耐藥基因，加快了質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因在細(xì)菌間的傳播進(jìn)程。

截至目前，據(jù)全質(zhì)粒測序分析發(fā)現(xiàn)攜帶blaKPC耐藥基因的質(zhì)粒有近50種，KPC的blaKPC耐藥基因最常見于IncF型質(zhì)粒上[12]。希臘曾暴發(fā)過由IncFⅡK質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)KPC-2酶大腸埃希菌(ST410)的廣泛流行，在此之前，該質(zhì)粒曾介導(dǎo)過肺炎克雷伯菌在希臘的廣泛傳播[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌中有4個(gè)屬6個(gè)種的耐碳青霉烯酶腸桿菌的blaKPC耐藥基因均存在于pUVA01質(zhì)粒上[14]。介導(dǎo)blaKPC耐藥基因傳播的質(zhì)粒具有廣譜宿主性和多樣性。

介導(dǎo)blaKPC耐藥基因傳播的質(zhì)粒具有廣譜宿主性和多樣性，質(zhì)粒的某些特性賦予了它更多的傳播方式，使其介導(dǎo)耐藥基因的傳播過程也變得更容易，從而更易導(dǎo)致耐藥菌的廣泛流行。

2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的blaKPC耐藥基因傳播機(jī)制

轉(zhuǎn)座子(Tn)是指能將自身基因插入基因組中任何一個(gè)序列的一組DNA序列，它可以在基因組上進(jìn)行自由移動(dòng)[15]。轉(zhuǎn)座子可以介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶基因，通過水解β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而導(dǎo)致blaKPC耐藥基因的水平傳播[16]。

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告表明，轉(zhuǎn)座子Tn4401是歐美地區(qū)最常見的攜帶blaKPC的基因元件[17]。Tn4401轉(zhuǎn)座子全長10 kb左右，其結(jié)構(gòu)組成包括blaKPC-2基因、轉(zhuǎn)座酶基因(tnp A)、解離酶基因(tnp R)和ISKpn6、ISKpn7兩個(gè)插入序列。Tn4401序列兩邊有5 bp的靶位復(fù)制序列，可以攜帶著blaKPC以較高的頻率插入到不同質(zhì)粒的開放讀碼框(ORF)中，這就使得blaKPC耐藥基因得以在相同菌種甚至不同菌種間實(shí)現(xiàn)快速播散，因此Tn4401被認(rèn)為加速了產(chǎn)酶菌株的全球擴(kuò)散[18-19]。不同于歐美地區(qū)，在我國，復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn3-Tn4401和轉(zhuǎn)座子Tn1721是國內(nèi)產(chǎn)菌株最常報(bào)道的攜帶blaKPC耐藥基因的基因元件，尤其是在江浙地區(qū)報(bào)道的菌株中經(jīng)常出現(xiàn)。這種復(fù)合轉(zhuǎn)座子被認(rèn)為是基于Tn3的轉(zhuǎn)座子和部分Tn4401結(jié)構(gòu)的整合，其ORF順序?yàn)椋篢n3轉(zhuǎn)座子的Tn3-轉(zhuǎn)座酶和Tn3-解旋酶、ISKpn8、blaKPC-2基因和ISKpn6樣元件，該轉(zhuǎn)座子僅有2 070 bp的區(qū)域與Tn4401相同，包括blaKPC-2基因和類似ISKpn6的ORF[20]。位于復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn3-Tn4401中ISKpn8插入序列下游的blaKPC-2耐藥基因，往往是以Tn3-Tn4401復(fù)合轉(zhuǎn)座子的整體形式進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而非單獨(dú)隨ISKpn8一起移動(dòng)[20]。Tn1721轉(zhuǎn)座子是我國早期報(bào)道的與blaKPC基因傳播有關(guān)的轉(zhuǎn)座子，最近有研究表明，我國東部地區(qū)blaKPC-2基因主要位于2種Tn1721轉(zhuǎn)座子亞型，其分別被命名為Tn1721A和Tn1721B；Tn1721A的結(jié)構(gòu)與Tn1721B的不同之處在于Tn1721A不包含額外的IRL和IRL2等附加的反向重復(fù)序列[21]。無論blaKPC-2耐藥基因是位于轉(zhuǎn)座子內(nèi)部還是外部，都可隨Tn1721轉(zhuǎn)座子運(yùn)動(dòng)，通過轉(zhuǎn)座子插入到質(zhì)粒中來介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播，但相較于轉(zhuǎn)座子Tn4401無特異性的插入位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座子Tn1721插入位點(diǎn)基因的周圍環(huán)境表現(xiàn)為AT含量由兩端向中間遞減的趨勢[21]，這表明轉(zhuǎn)座子Tn1721的插入位點(diǎn)可能更具特異性。此外，有研究發(fā)現(xiàn)含blaKPC-3基因的Tn4401轉(zhuǎn)座子可直接插入到一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn1331中[22]。

攜帶KPC基因的Tn4401轉(zhuǎn)座子可直接插入到質(zhì)粒中進(jìn)行傳播，融入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)大多保持了其自身的轉(zhuǎn)座能力，同時(shí)也可以隨質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳播。這種傳播方式在介導(dǎo)blaKPC耐藥基因進(jìn)行水平傳播的過程中存在著至關(guān)重要的作用。

3 整合子介導(dǎo)的blaKPC耐藥基因傳播機(jī)制

整合子是存在于很多細(xì)菌中的一種具有運(yùn)動(dòng)屬性的DNA分子，常定位于質(zhì)粒、染色體和轉(zhuǎn)座子上，其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可以捕獲外源基因特別是耐藥基因并穩(wěn)定表達(dá)，以此來提高細(xì)菌對(duì)周圍環(huán)境改變的耐受性。整合子可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子，intI1、intI2、intI3分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的遺傳標(biāo)記。研究表明，攜帶blaKPC基因的肺炎克雷伯菌對(duì)抗生素具有耐藥性與Ⅰ、Ⅱ類整合子密切相關(guān)，與Ⅲ類整合子相關(guān)性不大[23-24]。blaKPC耐藥基因以基因盒的形成位于整合子可變區(qū)，可隨整合子在不同細(xì)菌之間水平傳播。攜帶耐藥基因的整合子隨其他可移動(dòng)遺傳元件(如轉(zhuǎn)座子等)融合到質(zhì)粒上，從而介導(dǎo)耐藥基因在不同菌株間發(fā)生水平傳播。

4 插入序列介導(dǎo)的blaKPC耐藥基因傳播機(jī)制

插入序列(IS)是編碼轉(zhuǎn)座酶的一段DNA序列，大小一般在600～2 000 bp，可看成一種簡單形式的轉(zhuǎn)座子。有研究認(rèn)為在轉(zhuǎn)座子Tn4401的形成過程中，ISKpn6和ISKpn7分別插入到blaKPC上下游，破壞IRR1，從而形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子Tn4401[19]，并隨轉(zhuǎn)座Tn4401轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒上介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播。

被插入序列插入的位點(diǎn)基因可因受損不再表達(dá)而導(dǎo)致基因失活，稱為插入失活(insertional inactivation)[25]，從而使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥。甚至可因此而產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)座子突變體，如：國內(nèi)曾報(bào)道了轉(zhuǎn)座子Tn1721的突變體，就是由于IS26在Tn3的tnpA插入導(dǎo)致tnpA丟失，形成了一種Tn1721-blaKPC-2-△Tn3-IS26樣的新結(jié)構(gòu)[26-27]。

插入序列作為轉(zhuǎn)座子的一部分，可攜帶blaKPC耐藥基因隨轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒上介導(dǎo)耐藥基因的水平傳播[28]，亦可導(dǎo)致插入位點(diǎn)基因的失活，形成一種轉(zhuǎn)座子突變體，從而介導(dǎo)新的耐藥機(jī)制的產(chǎn)生。

5 噬菌體/噬菌體原介導(dǎo)的blaKPC耐藥基因傳播機(jī)制

噬菌體在自然界中含量豐富，其結(jié)構(gòu)簡單，適應(yīng)性強(qiáng)，容易在各種生存環(huán)境長期存活，因此它是耐藥基因轉(zhuǎn)移的最合適載體。噬菌體不僅可以介導(dǎo)耐藥基因在同一種屬細(xì)菌之間傳播，還可以介導(dǎo)耐藥基因的跨細(xì)菌種屬傳播，對(duì)細(xì)菌基因組的多樣性和進(jìn)化發(fā)揮了重要作用[28]。

目前已在臨床肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了P7-like噬菌體并攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1[29]。有研究報(bào)道，存在于菌體中的噬菌體原(prophage)可以幫助大腸埃希菌拮抗β-內(nèi)酰胺類藥物，這也許跟某些噬菌體原自身含有的耐藥基因有關(guān)，也可能是通過菌體中的某些特定蛋白抑制細(xì)菌的細(xì)胞分裂，使得細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性下降，從而介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[30]。對(duì)于噬菌體原是否能通過類似機(jī)制來介導(dǎo)blaKPC基因進(jìn)行廣泛傳播尚不清楚，噬菌體原介導(dǎo)耐藥基因的傳播機(jī)制需要進(jìn)一步研究完善。

6 結(jié)語

blaKPC基因可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)遺傳元件進(jìn)行傳播，blaKPC基因在不同地區(qū)的流行可通過不同的可移動(dòng)遺傳元件，或同種可移動(dòng)遺傳元件中不同類型的小元件進(jìn)行水平傳播，表明blaKPC基因環(huán)境與擴(kuò)散轉(zhuǎn)移可能存在地域差異。目前關(guān)于blaKPC基因的具體播散規(guī)律尚不完善，因此需要更多的相關(guān)研究進(jìn)行深入探索。可移動(dòng)遺傳元件介導(dǎo)blaKPC基因水平傳播所導(dǎo)致的CRKP全球播散給公共衛(wèi)生造成了極大的威脅，耐藥形勢十分嚴(yán)峻。當(dāng)前各級(jí)醫(yī)院需加強(qiáng)院內(nèi)感染的控制，合理使用抗菌藥物，以及定期進(jìn)行環(huán)境清潔和設(shè)備消毒。