NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷中作用的研究進(jìn)展

田明巧，官勁帆，安露露 綜述 韓江全 審校

遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 珠海 519100

目前腦卒中已經(jīng)是我國致死率第一位的疾病，與缺血性心臟病、支氣管肺癌并稱為我國健康的三大殺手[1]，而腦卒中的患者中大約70%為腦梗死[2]。腦梗死發(fā)生后，除超早期的血管內(nèi)治療外，尚無其他明顯有效的治療措施，因此，發(fā)現(xiàn)和尋找治療腦梗死的新靶點(diǎn)仍是腦梗死防治研究中的重點(diǎn)。炎癥小體是一種大分子復(fù)合物，可在感受到細(xì)胞內(nèi)各種刺激后進(jìn)行組裝，炎性小體的組裝引起天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)激活，從而促進(jìn)具有生物活性的白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素18(IL-18)的分泌，并誘發(fā)稱為焦亡的炎性細(xì)胞死亡[3]。炎性小體的效應(yīng)器有效地驅(qū)動(dòng)免疫反應(yīng)，并介導(dǎo)腦梗死發(fā)生后無菌性炎癥反應(yīng)過程的控制。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3[nucleotide binding and oligomerization(NOD)-like receptor pyrin domain containing-3，NLRP3]炎癥小體是最早發(fā)現(xiàn)的炎癥小體之一，研究表明通過抑制NLRP3炎癥小體激活可以減輕梗死后神經(jīng)細(xì)胞的缺血性損傷[4]，因此對(duì)NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷的作用及其機(jī)制做一綜述。

1 NLRP3的概述

免疫系統(tǒng)是宿主防御的重要組成，種系編碼的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)參與激活免疫系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)入侵的病原體、死亡細(xì)胞或環(huán)境刺激物的有害刺激[5]。PRRs識(shí)別由內(nèi)源性應(yīng)激產(chǎn)生的獨(dú)特微生物成分，稱為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，并觸發(fā)下游的炎癥通路，以消除微生物感染和修復(fù)受損組織[6]。炎癥小體是一組激活炎癥性Caspase-1的胞內(nèi)多聚蛋白復(fù)合物，由其敏感蛋白(一種PRR)定義，PRR寡聚形成親Caspase-1的活化平臺(tái)，以應(yīng)對(duì)DAMPs或PAMPs。已有4個(gè)PRRs成員被明確證實(shí)可以形成炎性小體：NLRP1、NLRP3和NLRC4，以及黑素瘤缺乏因子2(absent-in-melanoma2，AIM2)[7-8]。

2002年MARTINON的團(tuán)隊(duì)最早發(fā)表了關(guān)于NLRP3炎癥小體的概念，當(dāng)時(shí)他們揭示了組織損傷、先天免疫過程和Caspase-1依賴性反應(yīng)之間的關(guān)鍵聯(lián)系[9]。NLRP3炎癥小體通常有三種主要成分：NLRP3受體蛋白、Caspase-1酶和促進(jìn)兩者相互作用的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白[apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]。NLRP3是最典型的炎癥小體傳感器分子，由人類的22個(gè)基因家族編碼，是NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族的三方蛋白質(zhì)，包含一個(gè)氨基末端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)、一個(gè)核苷酸結(jié)合的中央NACHT結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)[10]。ASC蛋白由PYD和羧基末端的CARD組成，相比之下，Caspase-1具有一個(gè)CARD域、一個(gè)中央大催化域和一個(gè)羧基末端的小催化亞基域，NLR蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為能夠抑制炎性體的自激活[11-12]。在穩(wěn)定狀態(tài)下，LRR結(jié)構(gòu)域折回到傳感器分子的NACHT結(jié)構(gòu)域上，該結(jié)構(gòu)被認(rèn)為具有NLRP3活性基礎(chǔ)的三磷酸腺苷酶功能。在適當(dāng)?shù)拇碳みM(jìn)行感測(cè)和激活后NLRP3發(fā)生寡聚，并通過兩種蛋白PYD之間的相互作用進(jìn)一步募集ASC，促使螺旋形ASC細(xì)絲形成，并組裝成一個(gè)大的ASC斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)[13-14]。在形成ASC斑點(diǎn)后，Caspase-1通過同型CARD-CARD相互作用被募集，從而使鄰近誘導(dǎo)的Caspase-1自我切割，并通過在p20-p10接頭區(qū)域的切割而激活[15]?；钴S的Caspase-1誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的失活前體形式蛋白水解成為它們的生物學(xué)活性形式，Caspase-1也將消皮素D裂解成其活性N端片段，從而誘導(dǎo)一種稱為焦亡的炎癥形式的細(xì)胞死亡[16-17]。

2 NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷中的作用

腦梗死是一種急性疾病，其特征是流向腦組織的血流量突然減少，導(dǎo)致神經(jīng)功能受損或喪失。腦梗死后，多種機(jī)制參與缺血性腦損傷，包括生物能衰竭、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)喪失、細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高、活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的毒性、花生四烯酸產(chǎn)物的產(chǎn)生、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞和白細(xì)胞浸潤等[18]。其中炎癥反應(yīng)是缺血性損傷的重要環(huán)節(jié)，在腦梗死的整體發(fā)病機(jī)理中起重要作用，最初是導(dǎo)致缺血性腦損傷，然后是組織再生。最近的研究提供了新的炎癥機(jī)制的思路，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)膜上的PRRs激活某些炎癥信號(hào)通路，促使腦梗死缺血核心帶壞死細(xì)胞釋放內(nèi)源性DAMPs的反應(yīng)，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加和NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡[19]。在小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型中，缺血側(cè)腦組織NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，持續(xù)升高超過48 h，NLRP3表達(dá)增加的同時(shí)又進(jìn)一步加重腦缺血損傷，而給予免疫球蛋白可抑制NLRP3活化發(fā)揮抗腦缺血性損傷作用[20]。NLRP3的活化不僅存在于神經(jīng)元中，也存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中，減少NLRP3的活化，能抑制星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低促炎因子的水平，從而減輕炎癥反應(yīng)[21]。此外，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)腦缺血的BBB損傷，通過抑制NLRP3炎癥小體能減輕腦缺血后BBB的損傷，這與增強(qiáng)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)有關(guān)[22]。新近大量的研究證實(shí)，通過抑制NLRP3的活化可改善缺氧缺血細(xì)胞模型和腦梗死動(dòng)物模型中的缺血性損傷和神經(jīng)血管并發(fā)癥[23]。

促進(jìn)IL-1β和IL-18的釋放以及誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡是NLRP3炎癥小體參與機(jī)體糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心室重塑等多種病理過程的重要機(jī)制，激活NLRP3炎癥小體加劇腦缺血損傷也與促進(jìn)IL-1β和IL-18釋放以及細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。IL-1β和IL-18是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用，它可能是大腦的一線免疫防御，主要由人類的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，并加速與自身免疫、炎癥和感染相關(guān)的各種適應(yīng)性和先天免疫過程[24-26]。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病共有的細(xì)胞損傷機(jī)制均與IL-1β和IL-18的有害性相關(guān)，缺血性腦損傷發(fā)生后IL-1β和IL-18介導(dǎo)谷氨酸興奮毒性與氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)和BBB，加劇腦水腫，最終導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞死亡[19]。NLRP3炎癥小體在腦梗死發(fā)生后被迅速激活，通過上調(diào)caspase-1水平增強(qiáng)IL-1β和IL-18的表達(dá)，使梗死體積增大和加重缺血性腦損傷[26]。FANN團(tuán)隊(duì)最新研究中，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)小鼠腦缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷模型，在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGDR)模擬I/R，并同時(shí)對(duì)缺血側(cè)腦組織和OGDR皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的蛋白水平及炎性成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腦組織及神經(jīng)元細(xì)胞中NLRP3蛋白以及IL-1β、IL-18的水平顯著增加，而利用Caspase-1抑制劑治療可在實(shí)驗(yàn)性I/R模型中通過下調(diào)IL-1β和IL-18的水平保護(hù)體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞[27]。

細(xì)胞焦亡是依賴于炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡的一種模式，對(duì)于體內(nèi)清除病原體是必不可少的，其兩個(gè)標(biāo)志性特征是DNA損傷和膜破裂，前者類似于細(xì)胞凋亡，而后者則完全相反[4]。當(dāng)機(jī)體受到毒性刺激時(shí)，有害的胞內(nèi)和胞外信號(hào)通過依賴于Caspase-1的經(jīng)典焦亡途徑誘導(dǎo)胞漿內(nèi)炎性成分的形成，其主要與非感染性炎癥有關(guān)，腦梗死屬于典型的非感染性炎癥[28]，因此Caspase-1在腦梗死后的細(xì)胞焦亡過程中具有重要作用。Caspase-1在神經(jīng)元、活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并且通過抑制Caspase-1表達(dá)能使神經(jīng)細(xì)胞免受腦梗死的缺血性損傷[29]。細(xì)胞焦亡主要發(fā)生于腦梗死缺血半暗帶，缺血核心區(qū)域的壞死細(xì)胞分泌能引發(fā)炎癥介質(zhì)的危險(xiǎn)信號(hào)DAMPs，從而加劇細(xì)胞腫脹，加速腦細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，在SD大鼠I/R模型中，通過檢測(cè)缺血海馬及皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞焦亡，其結(jié)果顯示缺血側(cè)在造模后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞焦亡陽性率最高，證明細(xì)胞焦亡在I/R后神經(jīng)細(xì)胞損傷中具有重要作用[30]。而且在I/R的體內(nèi)和體外模型中，NLRP3炎癥小體表達(dá)顯著升高并誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞焦亡增加，進(jìn)一步加重神經(jīng)功能損傷，而靶向抑制NLRP3炎癥小體活化后，神經(jīng)元細(xì)胞的焦亡表現(xiàn)明顯改善[31]。總之，NLRP3炎癥小體主要是通過增加下游的IL-1β和IL-18釋放以及誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞焦亡，從而加劇缺血性腦損傷后炎癥反應(yīng)、加速BBB破壞以及促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生等病理過程的發(fā)展。

3 缺血性腦損傷中NLRP3炎癥小體激活的潛在調(diào)控機(jī)制

3.1 嘌呤能離子通道型7受體(purinergic ligand-gated ion-channel7receptor，P2X7R) P2X7R是嘌呤能2型受體家族的配體門控離子通道，由嘌呤2型G蛋白偶聯(lián)受體(P2YG)和嘌呤2型X受體(P2X)7組成，能被細(xì)胞外ATP(extracellular ATP，eATP)封閉，允許陽離子非選擇性地通過，而毫摩爾濃度的eATP持續(xù)刺激其觸發(fā)非選擇性孔形成，從而允許高達(dá)900 Da的分子通過，Na+和Ca2+內(nèi)流以及K+外排導(dǎo)致細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的變化；此外，P2X7R可以通過其固有的成孔能力與泛連接蛋白半通道的結(jié)合來引發(fā)大規(guī)模細(xì)胞內(nèi)ATP的釋放，從而促進(jìn)嘌呤能信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)[32]。細(xì)胞內(nèi)離子改變?cè)贜LRP3激活中的重要作用已經(jīng)得到支持，P2X7R和NLRP3炎癥小體能在分離的細(xì)胞質(zhì)下相互作用，細(xì)胞膜通道的開放導(dǎo)致胞內(nèi)K+減少，增強(qiáng)了NLRP3與NEK7蛋白的相互作用，而NEK7蛋白是不可缺少的NLRP3激活劑，除此之外，P2X7R刺激還產(chǎn)生了其他觸發(fā)NLRP3活性的物質(zhì)，如ROS和組織蛋白酶[33]。NLRP3炎癥小體是P2X7R調(diào)節(jié)腦損傷后炎癥潛在的信號(hào)分子，通過激動(dòng)P2X7R可以使NLRP3激活促進(jìn)腦組織中的炎癥反應(yīng)[34]。還有研究表明，在小鼠MCAO模型和缺血缺氧體外模型中進(jìn)行蛋白印跡分析，發(fā)現(xiàn)缺血腦組織中P2X7R以及NLRP3炎癥小體成分顯著增加，利用P2X7R拮抗劑BBG阻斷P2X7R可以減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及抑制梗死后缺血側(cè)神經(jīng)元凋亡，并保護(hù)培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元免受缺血缺氧誘導(dǎo)的體外損傷，同時(shí)缺血側(cè)腦組織中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)顯著降低，由此推測(cè)該神經(jīng)保護(hù)作用與拮抗P2X7R從而減少NLRP3炎癥小體活化密切相關(guān)[35]。

3.2 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族由細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和P38蛋白三個(gè)亞族組成，各種應(yīng)激因素刺激MAPK途徑通過G蛋白偶聯(lián)受體激活三層Raf/MEK/ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而且應(yīng)激激活的MAPK在能擴(kuò)大炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)加重組織損傷[36]。最新研究發(fā)現(xiàn)，P38 MAPK激活可促進(jìn)巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性小體多個(gè)方面的功能，包括前體IL-1β的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)、NLRP3受體合成、NLRP3炎性小體復(fù)合物的激活以及分泌的IL-1β的下游炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)[37]。腦梗死發(fā)生后，缺血側(cè)神經(jīng)元中發(fā)生MAPK信號(hào)的激活，其不利于神經(jīng)元的存活，并且MAPK的藥理學(xué)抑制作用可保護(hù)神經(jīng)元在缺血條件下免受凋亡性細(xì)胞死亡。通過證實(shí)，在局部缺血條件下，MAPK介導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用與NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)，在神經(jīng)元中抑制MAPK的表達(dá)可以降低外周免疫細(xì)胞中NLRP3蛋白活化從而改善缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡[20]。除此之外，炎癥反應(yīng)是缺血性腦損傷BBB破壞的主要原因，BBB的破壞進(jìn)一步引起繼發(fā)性損傷和功能障礙，增加出血的風(fēng)險(xiǎn)并限制組織的恢復(fù)，但是通過抑制MAPK減少NLRP3炎癥小體的表達(dá)可以使腦缺血后BBB的分解得到改善[22]，從而改善腦缺血后神經(jīng)功能損傷。

3.3 核因子E2相關(guān)因子-2(Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路 Nrf2/ARE信號(hào)通路在細(xì)胞抗氧化和抗炎反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，一般情況下，Nrf2被Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)隔離在細(xì)胞質(zhì)中，Keap1被激活后釋放Nrf2并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在其中與ARE結(jié)合從而促進(jìn)下游靶基因如醌氧化還原酶(NQO1)的轉(zhuǎn)錄。Nrf2/ARE調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化和抗炎防御系統(tǒng)中涉及的200多種內(nèi)源性保護(hù)基因，包括Ⅱ期抗氧化劑/排毒酶基因以及抗炎共刺激基因和分子伴侶基因，這些保護(hù)性基因在提高組織抗氧化能力以及發(fā)揮抗毒素、抗炎和抗凋亡作用中起著重要作用[38]。Nrf2/ARE的抗炎作用與在炎癥反應(yīng)過程中抑制NLRP3炎癥小體激活密切相關(guān)，通過依賴Nrf2的方式激活A(yù)RE來誘導(dǎo)NQO1表達(dá)，可以抑制巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化、Caspase-1裂解和IL-1β生成[39]。氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)的常見特征，在缺血性腦損傷病理過程中起關(guān)鍵作用，作為靶向Nrf2/ARE的基因，NQO1被認(rèn)為是可調(diào)節(jié)的ROS產(chǎn)生的誘導(dǎo)性細(xì)胞保護(hù)基因，在通過OGDR誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞體外模型中，激活Nrf2/ARE信號(hào)通路能增強(qiáng)NQO1的表達(dá)從而清除ROS，同時(shí)降低OGDR誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3、ASC和Caspase-1的表達(dá)，表明激活Nrf2/ARE信號(hào)通路減少NLRP3炎癥小體表達(dá)從而改善腦缺血損傷氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，因此，Nrf2/ARE信號(hào)通路可能是抑制NLRP3炎癥小體激活發(fā)揮治療缺血性腦損傷的潛在靶標(biāo)[40]。

4 展望

NLRP3炎癥小體在缺血性腦損傷的病理過程中具有重要作用，NLRP3炎癥小體激活后促進(jìn)IL-1β及IL-18的釋放以及調(diào)控細(xì)胞焦亡均能加劇梗死后缺血性損傷。除此之外，在臨床研究中還發(fā)現(xiàn)患者血液中NLRP3炎癥小體轉(zhuǎn)錄水平越高，急性腦梗死的預(yù)后越差，其原因可能是NLRP3炎癥小體加劇腦梗死炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及對(duì)抗抗栓藥物的治療作用[41]。但是目前臨床上NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑研究還較少，P2X7R、MAPK和Nrf2/ARE信號(hào)通路都是調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體激活的潛在機(jī)制，可以為未來對(duì)腦梗死的防控及治療提供了新的思路，而且還能為研發(fā)NLRP3炎癥小體抑制劑提供新的方向，但是更具體的調(diào)控機(jī)制仍需更多的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)加以研究。