牽張應(yīng)力刺激介導(dǎo)間充質(zhì)干細胞的信使RNA和長鏈非編碼RNA表達譜變化

鄒慶寶 靳松 黃愛軍

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是人體內(nèi)重要的多能干細胞，廣泛存在與骨髓、脂肪和肌腱止點等結(jié)締組織中，除了具有支持造血干細胞的作用外，還具有對免疫系統(tǒng)多種細胞的抑制能力[1]。除此之外，MSC還具有強大的多向分化能力，可以在不同條件下分化為骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[2]。新近研究顯示，人體內(nèi)的成骨細胞主要由MSC分化而來[3]。由于具有體外易于擴增、免疫原性低的特點，近年來MSC已在組織修復(fù)重建、生物醫(yī)學(xué)工程中廣泛使用，具有良好的臨床應(yīng)用前景[4]。

機械應(yīng)力，特別是牽張應(yīng)力，是影響人體內(nèi)骨骼形成與發(fā)育的關(guān)鍵原因之一，是維持骨組織應(yīng)力平衡的重要因素[5]。近年來，許多研究已經(jīng)證實牽張應(yīng)力可以通過改變MSC基因表達譜以影響其成骨分化能力，從而參與調(diào)控機體內(nèi)的骨修復(fù)與重建平衡，但目前機制尚未完全闡明[6]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc- RNA）是一種長度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。既往認為，非編碼RNA只是細胞轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)的無用物質(zhì)，然而新近的研究卻顯示lnc-RNA可以通過多種方式，參與細胞中各種功能的調(diào)控[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNA可以參與MSC成骨分化的調(diào)控，但lnc-RNA是否參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)的MSC成骨分化，目前尚沒有研究[8]。在本研究中，對牽張應(yīng)力刺激下的MSC成骨分化能力及其lnc-RNA表達譜進行檢測，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、主要材料與儀器

1.主要材料：DMEM培養(yǎng)基、0.25﹪胰蛋白酶-EDTA（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；CBA蛋白定量試劑盒（康為公司）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成公司）；PBS緩沖液、RIPA蛋白提取液、Percoll分離液、氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC水、多聚甲醛溶液（碧云天公司）；地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、氯化十六烷基吡啶（CPC）、茜素紅染色試劑盒（美國Sigma公司）； Trizol提取液（美國Life公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）；Affymetrix mRNA+長鏈非編碼RNA表達譜芯片（美國Life公司）；FlexCell 6孔細胞培養(yǎng)板（美國FlexCell公司）；離心 管（15 ml、50 ml）、25 cm2培養(yǎng) 瓶、96 孔板（美 國Corning公司）；移液器（德國Eppendorf公司）。

2.儀器：生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、Nano分光光度計、酶標儀、PCR儀（美國Thermo Fisher公司）；FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)（美國FlexCell公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Hybridization Oven、Fluidics Station、GeneChip Scanner 3000 （美國Affymetrix公司）。

二、方法

1.正常MSC體外分離、培養(yǎng)：本研究獲得中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有骨髓捐獻志愿者均知曉本研究操作所具有的全部風(fēng)險，并簽署知情同意書。

本研究共募集6名骨髓捐獻正常志愿者，其中男3人、女3人、年齡（25.6±3.4）歲，排除禁忌癥后按照標準方法行骨髓穿刺術(shù)。穿刺成功后抽取骨髓5 ml，加入50 ml離心管中，并加入10 ml PBS緩沖液充分混勻。隨后將稀釋的骨髓樣本用注射器緩慢加入等量Percoll分離液，保持兩者液面穩(wěn)定。以500×g離心10 min，離心后可見兩液相界面有白色膜狀層。用移液器吸取中間白膜層，加入10 ml PBS緩沖液充分混勻，以500×g離心10 min，離心后可見細胞團塊沉淀于離心管底部。用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，進行細胞計數(shù)后以2×106個/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于37 ℃、5﹪CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕搖晃，洗去未貼壁細胞，加入新的含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每3天換液1次，當細胞達到80﹪～ 90﹪融合時，0.25﹪胰蛋白酶-EDTA消化傳代，第3代細胞用于進行下一步實驗。MSC分為應(yīng)力組與非應(yīng)力組，應(yīng)力組為接受應(yīng)力刺激的MSC，無應(yīng)力組為未接收應(yīng)力刺激的對照MSC。

2.成骨分化誘導(dǎo)與牽張應(yīng)力刺激：第3代MSC培養(yǎng)達90﹪融合時，按上述方法進行消化、計數(shù)，以1×105個/孔的密度接種于FlexCell 6孔板中，待細胞完全貼壁后換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10﹪胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10 nmol/L地塞米松的DMEM），放置于37℃、5﹪CO2環(huán)境下的FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)進行培養(yǎng)，牽張應(yīng)力設(shè)置條件為5﹪形變、頻率0.1 Hz、作用時間為每天4 h。此后每3天全量更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基至相應(yīng)實驗時間。

3.茜素紅染色與定量：MSC在牽張應(yīng)力刺激下進行成骨誘導(dǎo)至相應(yīng)時間點，棄去上清液，用PBS緩沖液輕輕清洗3次，隨后用4﹪多聚甲醛溶液在室溫下孵育固定5 min。棄去多聚甲醛溶液，用PBS緩沖液清洗3次，每孔加入茜素紅染色液2 ml，于室溫下染色10 min。染色完成后加入PBS緩沖液3 ml，于搖床上緩慢清洗5 min（3次），洗去非特異性染色與雜質(zhì)，于倒置相差顯微鏡下拍照記錄。拍照完成后，每孔加入1 ml的氯化十六烷基吡啶萃取液，于搖床上室溫孵育1 h，充分萃取染色。用移液器吸取200 μl萃取液加入96孔板中，于酶標儀下測定吸光度。

4.堿性磷酸酶活性測定：MSC誘導(dǎo)至10 d后，棄去上清液，用PBS緩沖液輕輕清洗3次每孔加入RIPA蛋白裂解液100 μl，冰上放置30 min。隨后吸取蛋白裂解液，于4℃下以3 000×g離心10 min。按照試劑盒方法配置堿性磷酸酶反應(yīng)液，于96孔板中每孔加入反應(yīng)液100 μl，同時加入蛋白上清30 μl，37 ℃孵育 15 min。隨后每孔加入顯色液 150 μl，充分混勻后通過酶標儀測吸光度。部分離心后的蛋白上清通過BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，對堿性磷酸酶進行標準化定量。

5.RNA提?。籂繌垜?yīng)力刺激下MSC成骨誘導(dǎo)至第7天，用PBS緩沖液輕輕清洗3次。每孔加入Trizol提取液1 ml，充分混勻后于冰上裂解5 min。將裂解液轉(zhuǎn)移至無酶EP管中，每管加入三氯甲烷200 μl，劇烈震蕩混勻后靜置 5 min，隨后 3 000×g離心10 min。離心后吸取上層水相液體并轉(zhuǎn)移入新的無酶EP管中，每管加入等量異丙醇，室溫靜置10 min后于3 000×g離心10 min。離心后可見RNA團塊沉淀于EP管底部，棄去上清液，加入75﹪乙醇1 ml充分混勻進行洗滌，以1 500×g離心10 min。棄去75﹪乙醇，加入20 μl無酶滅菌水。于Nanodrop紫外分光光度計下檢測RNA濃度與純度。

6.cDNA逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法，取無酶 EP 管，每管加入逆轉(zhuǎn)錄試劑 2 μl、RNA 8 μl，于PCR儀中以37 ℃孵育15 min。逆轉(zhuǎn)錄后cDNA加入40 μl DEPC水進行稀釋備用。

7.表達譜芯片檢測：逆轉(zhuǎn)錄完成的cDNA經(jīng)過標記、芯片雜交、清洗、染色、掃描，收集數(shù)據(jù)后采用AGCC等軟件進行分析，實驗方法按照既往文獻報道方案進行[8]。實驗完成后使用Agilent Feature Extraction（v10.7）軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù)，然后使用 Agilent GeneSpring 軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。

8.生物信息學(xué)分析：對差異表達的mRNA進行 KEGG（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）信息學(xué)分析匯總，篩查差異表達的相關(guān)信號通路。根據(jù)序列相似性和表達相關(guān)性進行比對分析，鑒定lnc-RNA與mRNA共表達子集。通過NCBI-Blast程序比對共表達子集的lnc-RNA和mRNA的序列相關(guān)性。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計，茜素紅定量、堿性磷酸酶活性結(jié)果以表示，成骨 0天、14天應(yīng)力組與無應(yīng)力組的茜素紅定量、堿性磷酸酶定量結(jié)果采用兩樣本t檢驗進行比較，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、牽張應(yīng)力促進MSC成骨分化

將MSC接種于膠原I孵育的6孔板中，置于FlexCell細胞牽張應(yīng)力系統(tǒng)，在5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下進行成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)力刺激下的MSC在成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性達（265.3±31.2） U/L，而無應(yīng)力組MSC成骨誘導(dǎo)第10天堿性磷酸酶活性僅為（121.2±21.2） U/L，應(yīng)力組高于無應(yīng)力組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。此外，成骨誘導(dǎo)第14天應(yīng)力組MSC茜素紅染色較無應(yīng)力組MSC加深，應(yīng)力組MSC茜素紅定量OD值達1.46±0.19，無應(yīng)力組MSC茜素紅定量為0.62±0.08，應(yīng)力組高于無應(yīng)力組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。這提示牽張應(yīng)力可以促進MSC成骨分化（圖 1）。

圖1 應(yīng)力刺激下MSC成骨分化能力觀察（茜素紅染色，×40）

二、牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化mRNA和lnc-RNA表達譜

在成骨誘導(dǎo)第7天，分別提取無應(yīng)力組與應(yīng)力刺激組MSC的RNA進行全基因組mRNA+lnc-RNA表達譜芯片實驗。通過實驗，發(fā)現(xiàn)差異表達的mRNA共有598個，其中上調(diào)的mRNA有313個、下調(diào)的mRNA有285個（圖2A），差異表達的前5 位的mRNA詳見表1。此外，發(fā)現(xiàn)差異表達的lnc-RNA有329個，其中上調(diào)lnc-RNA有151個，下調(diào)的lnc-RNA有178個（圖2B），差異表達的前5位的lnc-RNA詳見表2。對差異表達的lnc-RNA進行分類，其中基因間lnc-RNA有92個、內(nèi)含子lnc-RNA有64個、正義鏈lnc-RNA有84個、反義鏈lnc-RNA有61個，雙向lnc-RNA有28個。這些結(jié)果提示應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達譜發(fā)生顯著改變，從而影響其成骨分化能力。

表1 差異表達的前5位的mRNA

表2 差異表達的前5位的lnc-RNA

三、差異mRNA和Lnc-RNA的生物信息學(xué)分析

為了探討差異mRNA相關(guān)的信號通路及其對應(yīng)功能，進行KEGG生物信息學(xué)分析。通過分析，發(fā)現(xiàn)有5個信號通路的表達變化具有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為WNT/β信號通路、Cytokine-Cytokine receptor信號 通路、Cell Cycle信號 通 路、Focal Adhesion信號通路和Lipoic acid metabolism 信號通路。WNT信號通路是差異表達最顯著的信號通路，共有11個差異表達基因，其中WNT5a上調(diào)最為明顯（6.74倍）（表 3）。

圖2 應(yīng)力刺激下MSC的mRNA和lnc-RNA表達譜

為了探討WNT5a表達上調(diào)的機制，以WNT5a的表達和序列為基礎(chǔ)，與差異表達的329個lnc-RNA進行共表達相關(guān)性分析和序列比對分析。通過分析，發(fā)現(xiàn)有3個差異表達的lnc-RNA與WNT5a具有共表達相關(guān)性，分別為 ENSG00000237298.2、ENSG00000241956.5 和ENSG00000187229.3（表4）；通過序列對比分析，結(jié)果提示ENSG00000237298.2序列中與WNT5a的編碼序列有部分結(jié)合位點，提示W(wǎng)NT5a可能是受到ENSG00000237298.2表達調(diào)控的靶基因，將ENSG00000237298.2命 名 為lnc-RNA-SSR（long non-coding RNA Strain Stimulation Related）。 這 些結(jié)果提示在應(yīng)力刺激下，lnc-RNA-SSR的表達增加，從而上調(diào)WNT5a表達、促進MSC成骨分化。

表3 KEGG分析差異表達信號通路

表4 與WNT5a共表達的lnc-RNA分析

討 論

1974年，國外學(xué)者Friedenstein等[9]首次證實在骨髓微環(huán)境中存在成纖維細胞樣、長梭型細胞，并將其命名為間充質(zhì)干細胞（MSC），這些細胞作為骨髓微環(huán)境壁龕細胞，具有支持造血干細胞的重要功能。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，MSC廣泛存在于人體多種組織中，除了在骨髓中含量豐富之外，還存在于脂肪、臍帶等多種結(jié)締組織和外周血循環(huán)中[1]。新近研究顯示，MSC不僅具有強大的免疫調(diào)節(jié)能力和較低的免疫原性，還具有多項分化的功能，可以分化為成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞。近年來，一系列的實驗均證實，MSC是人體內(nèi)成骨細胞的主要來源[3]。MSC強大的成骨分化功能使其可以廣泛應(yīng)用于骨折修復(fù)、損傷重建等組織再生工程中，具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。

機械應(yīng)力是一種廣泛存在于人體中的物理刺激信號，而牽張應(yīng)力是其中最重要的一類機械應(yīng)力刺激。牽張應(yīng)力存在于所有細胞微環(huán)境中，主要由肌肉產(chǎn)生并直接作用于骨骼，直接對骨骼相關(guān)細胞的增殖、凋亡和分化等功能產(chǎn)生重要影響，從而影響局部骨組織骨量[10]。當人體處于低牽張應(yīng)力情況下（失重、長期臥床），則會導(dǎo)致骨量降低；而當人體處于高牽張應(yīng)力、骨組織載荷增加情況下（運動員），則會增加機體骨量[11]。這主要是由于牽張應(yīng)力影響MSC成骨分化所決定的。MSC的成骨分化能力受到環(huán)境刺激、炎癥因子等多種因素的影響。大量實驗結(jié)果表明，適當增加牽張應(yīng)力刺激可以促進MSC成骨分化，牽張應(yīng)力預(yù)刺激下MSC移植后組織修復(fù)能力增強，大大提高了其在組織工程修復(fù)中的作用[12]。進一步深入探討牽張應(yīng)力刺激調(diào)控MSC成骨分化功能的機制，對于推動MSC臨床應(yīng)用意義重大。

在本研究中，通過茜素紅和堿性磷酸酶實驗，進一步證實5﹪形變、0.1 Hz、4 h/d條件下牽張應(yīng)力刺激可以促進MSC的成骨分化能力，這與既往文獻報道的結(jié)果一致[12]。此外，筆者也對不同牽張應(yīng)力刺激條件進行摸索，發(fā)現(xiàn)過強的牽張應(yīng)力刺激會大量誘導(dǎo)MSC凋亡，從而影響其成骨分化。這與臨床觀察中，適當?shù)膽?yīng)力或受力可以促進骨折愈合，但是過大過強的應(yīng)力刺激則會導(dǎo)致骨折延遲愈合的現(xiàn)象一致。此外，筆者進一步對成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進行全基因組表達譜芯片分析。經(jīng)過分析，共發(fā)現(xiàn)對比無應(yīng)力組，牽張應(yīng)力刺激下MSC共有598個基因差異表達，其中上調(diào)的有313個、下調(diào)285個。筆者進一步對差異表達的基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達的基因匯聚后共有5個信號通路存在異常表達，分別為WNT信號通路、Cytokine-Cytokine receptor信號通路、Cell Cycle信號通路、Focal Adhesion信號通路和Lipoic acid metabolism 信號通路，提示這些信號通路是牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化能力增強的關(guān)鍵。

WNT信號通路是介導(dǎo)MSC成骨分化的重要通路之一。已有研究證實，WNT信號通路激活可以促進MSC成骨分化[13]。WNT5a是WNT家族的一員，作為外分泌分子，WNT5a主要發(fā)揮激活WNT通路的作用，廣泛調(diào)控機體內(nèi)的多種細胞，參與組織發(fā)育、腫瘤生長等多種生理和病理過程[14]。既往已有研究提示W(wǎng)NT5a可以促進MSC成骨分化[12]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)WNT5a上調(diào)達6.74倍，為差異表達倍數(shù)最明顯的第二位基因。筆者推測，牽張應(yīng)力刺激導(dǎo)致MSC自分泌WNT5a增加，從而激活WNT信號通路，導(dǎo)致MSC成骨分化能力增強。

長鏈非編碼RNA是近年來研究的熱點，是一種長度大于200 nt、不具備編碼蛋白質(zhì)能力的RNA片段。lnc-RNA包括基因間、內(nèi)含子等多種類型，存在于細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中，可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種細胞的功能[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNA對MSC成骨分化的功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[8]，但在牽張應(yīng)力下MSC的lnc-RNA表達是否發(fā)生改變、是否參與了對MSC成骨分化功能的調(diào)控，目前尚未見研究。在本研究中，對成骨誘導(dǎo)分化后、牽張應(yīng)力刺激下的MSC進行l(wèi)nc-RNA表達譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)牽張應(yīng)力刺激后MSC的lnc-RNA表達譜發(fā)生差異改變，差異表達lnc-RNA達329個，提示lnc-RNA參與了牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化的過程。

lnc-RNA可以通過多種方式參與基因表達調(diào)控，但是發(fā)揮調(diào)控功能需具備2個前提：一是lnc-RNA與靶基因具有表達相關(guān)性，即具有共表達關(guān)系；二是lnc-RNA需存在與靶基因可能結(jié)合的位點[15]?；谏鲜鰞蓚€條件，筆者對以目標基因WNT5a作為核心進行共表達分析和序列比對分析，以進一步明確具體調(diào)控牽張應(yīng)力刺激下MSC成骨分化的關(guān)鍵lnc-RNA。本研究發(fā)現(xiàn)lnc-RNASSR在牽張應(yīng)力刺激下上調(diào)達4.11倍，且其表達與WNT5a的表達具有相關(guān)性，這說明2個分子之間存在明顯的表達聯(lián)系。進一步通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)lnc-RNA-SSR與WNT5a編碼序列有部分預(yù)測結(jié)合位點，這個結(jié)果提示lnc-RNASSR可能與WNT5a的mRNA序列結(jié)合。已有許多研究發(fā)現(xiàn)，lnc-RNA可與基因的轉(zhuǎn)錄本進行結(jié)合，對其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后修飾與調(diào)控作用，從而影響其表達水平[15]。筆者推測，lnc-RNA-SSR可能通過直接結(jié)合WNT5a編碼序列，以調(diào)控其表達水平改變，這需要在未來的研究中通過實驗進一步證明。此外，本研究雖還發(fā)現(xiàn)ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3與WNT5a有共表達關(guān)系，但由于生物信息學(xué)預(yù)測提示二者之間不存在結(jié)合位點，提示 ENSG00000241956.5、ENSG00000187229.3僅僅是成骨過程中伴隨出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本，不對WNT5a進行調(diào)控。

綜上所述，在本研究中進一步證實牽張應(yīng)力刺激下MSC的lnc-RNA表達譜發(fā)現(xiàn)明顯變化、成骨分化能力顯著增強。這可能是由于lnc-RNA-SSR表達上調(diào)，通過特異性調(diào)控WNT5a自分泌增加，從而介導(dǎo)WNT信號通路激活，最終導(dǎo)致MSC成骨分化增強。本研究探索了lnc-RNA表達譜在牽張應(yīng)力介導(dǎo)MSC成骨分化中的作用，對于促進MSC特異性分化及在組織再生工程中的應(yīng)用，具有重要意義。然而，本研究尚有不足，具體lnc-RNA-SSR調(diào)控WNT5a表達及WNT信號通路激活的機制尚未完全闡明，仍需要再未來的研究中進一步探索。