原花青素的研究進(jìn)展

劉玟君，李金洲，陳子雋，黃周艷，陳 勇

（1.廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧 530200；2.深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 深圳 518027；3.桂林市人民醫(yī)院，廣西 桂林 541002）

原花青素（Procyanidins，PC）是一類由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素通過C-C鍵縮合而形成的聚合物，又稱為縮合單寧［1］。根據(jù)原花青素聚合度的不同，又可分為單體、低聚和高聚原花青素，其中以二聚體分布最廣［2，3］。原花青素廣泛存在于多種植物的果、葉、子、皮中，其中葡萄子中原花青素的含量高達(dá)95%［4］。原花青素具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖等藥理活性［5］。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素的活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，聚合度較低的原花青素抗氧化性活性較強(qiáng)［6，7］。本研究主要對(duì)近五年有關(guān)原花青素的提取方法、含量測定方法、分離純化以及藥理活性等方面進(jìn)行整理歸納，以期為原花青素的研究提供指導(dǎo)。

1 原花青素的提取方法

提取是分離、鑒定和利用原花青素的重要步驟。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)于原花青素的提取方法主要有：溶劑提取法、酶提取法、超臨界CO2提取法、超聲波、微波輔助提取法等。

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是根據(jù)相似相溶的原理，選取對(duì)目標(biāo)成分溶解度大，而對(duì)非目標(biāo)成分的溶解度小的溶劑，從而將目標(biāo)成分從原料中提取出來的一種方法。原花青素可溶于水和絕大多數(shù)有機(jī)溶劑，常用的提取溶劑有水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮等［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，采用混合溶劑與采用單一溶劑（甲醇、乙醇）對(duì)葡萄子中原花青素進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)混合溶劑的提取率分別提高了13.38%和9.20%［9］。溶劑提取法雖然操作容易，對(duì)設(shè)備要求較低，但提取時(shí)間較長，提取率較低，且所用的有機(jī)溶劑很有可能會(huì)殘留在目標(biāo)成分中。

1.2 酶提取法

酶提取法是一種優(yōu)良的提取方法，有學(xué)者利用雙酶法破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的原花青素的快速溶出，再利用溶劑回流使原花青素成分有效提取出來，酶法提取能在一定程度上提高提取率，在生物活性物質(zhì)提取方面已被廣泛利用［10，11］。常用的酶有纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，其中pH、酶解時(shí)間、溫度等因素都會(huì)影響酶活性，所以必須嚴(yán)格控制反應(yīng)參數(shù)，且酶可能會(huì)造成中藥某些成分的變性分解，導(dǎo)致產(chǎn)物的純度降低［12，13］。

1.3 超臨界CO2提取法

CO2是最常用的超臨界流體，原花青素中含有多羥基基團(tuán)，而CO2屬于非極性溶劑，因此在提取原花青素過程中需加入一些極性夾帶劑，如水、乙醇、甲醇以及二氯甲烷等［14］。顏雪琴等［15］以乙醇為夾帶劑對(duì)石榴皮中的原花青素進(jìn)行提取，在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、料液比1.0∶1.3、CO2流速5 L/h、提取溫度48℃、提取壓力35 MPa條件下，試驗(yàn)所得到原花青素的提取率可達(dá)3.40%。

1.4 輔助提取方法

1.4.1 超聲波輔助提取 超聲波可以加速對(duì)植物細(xì)胞壁的破壞，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)加速溶出，從而提高提取率。目前，國內(nèi)外對(duì)原花青素的提取工藝較多，發(fā)現(xiàn)其研究集中在采用超聲波協(xié)同酶法、溶液提取法、機(jī)械研磨法等方面。有學(xué)者采用超聲波-乙醇法對(duì)山楂中原花青素進(jìn)行了提取工藝研究，發(fā)現(xiàn)采用該方法時(shí)，山楂中原花青素的提取率可達(dá)1.781%［16］。有研究采用超聲-微波協(xié)同法對(duì)酒花殘?jiān)械脑ㄇ嗨剡M(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)原花青素的提取率顯著高于超聲波提取法或微波提取法［17］。呂品等［18］首次將超聲波與酶解技術(shù)結(jié)合，對(duì)莽吉柿果殼中的原花青素進(jìn)行提取，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，其提取最佳工藝條件為纖維素酶用量2%、酶解時(shí)間68 min、酶解溫度58.5℃、超聲功率320 W、超聲時(shí)間20 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原花青素的提取率高于單獨(dú)使用超聲波和酶法提取。超聲波-機(jī)械研磨法是指在超聲波的基礎(chǔ)上，增加物理性外力，利用機(jī)械摩擦產(chǎn)生相應(yīng)機(jī)械剪切力來破壞植物的組織結(jié)構(gòu)，從而增加有效成分的溶出。程海濤等［19］利用超聲波-機(jī)械研磨協(xié)同法提取彩椒中原花青素，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，最終原花青素的提取率可達(dá)6.211 mg/g。

1.4.2 微波輔助提取 在微波場中，不同物質(zhì)吸收微波的能力不同，使得不同的物質(zhì)被選擇性加熱，加速目標(biāo)成分的溶出。微波輔助提取能顯著縮短提取時(shí)間，增加提取率。張兵兵等［20］采用微波-酶法對(duì)葡萄子中的原花青素進(jìn)行提取，并且經(jīng)過AB-8型大孔樹脂純化后，得到的原花青素純度為95.6%。容晨曦等［21］采用微波輔助法提取刺玫子中的原花青素，不僅顯著提高了原花青素的提取率，且縮短了提取時(shí)間和加熱時(shí)間。

2 原花青素的分離純化

植物中的化學(xué)成分復(fù)雜多樣，需要經(jīng)過反復(fù)的分離、純化等過程才能提高目標(biāo)成分的純度。目前，對(duì)于原花青素類化合物的純化，應(yīng)用最多的方法有膜結(jié)合柱層析法、大孔樹脂柱層析法、聚酰胺柱層析法、高速逆流色譜法等。

2.1 柱層析法

柱層析法又稱柱色譜法，是利用吸附劑對(duì)樣品中各組分吸附能力的不同，從而達(dá)到分離的一種方法，其中最常用有的吸附劑有硅膠、大孔樹脂、聚酰胺等［22］。梁敏等［23］選擇5種大孔吸附樹脂對(duì)葡萄子原花青素進(jìn)行純化，結(jié)果表明HPD400更適合葡萄子原花青素的分離與富集，純化后的原花青素含量可高達(dá)85%。聚酰胺中含有豐富的酰胺基團(tuán)，酰胺基團(tuán)可與化合物中的酚羥基形成氫鍵，由于形成氫鍵的數(shù)目、強(qiáng)度不同，聚酰胺對(duì)不同化合物的吸附能力也不同，利用不同梯度的甲醇或乙醇溶液進(jìn)行洗脫，溶劑分子可與酰胺基團(tuán)形成氫鍵，將化合物分子替換出來，從而達(dá)到分離的目的。聚酰胺柱層析主要用于黃酮類、多酚類化合物的分離純化。原花青素是一類以兒茶素或表兒茶素為結(jié)構(gòu)單元的縮合多酚類化合物，分子上有豐富的酚羥基，可與酰胺基團(tuán)形成氫鍵，因此，可以用聚酰胺對(duì)原花青素進(jìn)行分離純化。呂麗爽等［24］通過聚酰胺柱層析法對(duì)葡萄子中的物質(zhì)進(jìn)行分離純化，得到純度較高且抗氧化性能優(yōu)良的低聚花青素，純度可達(dá)到99%。紀(jì)秀鳳［25］先利用大孔樹脂對(duì)紅樹莓子中的原花青素進(jìn)行初步分離純化，得到純度較低的原花青素初純物，再經(jīng)聚酰胺二次純化，得到高純度低聚原花青素。

2.2 膜分離法

膜分離法是指采用具有選擇透過性的薄膜作為分離介質(zhì)，在濃度差、壓力差或電位差的作用下使混合物中的組分選擇性地透過膜，從而達(dá)到分離的目的。利用膜分離法可以除去混合物中的大分子物質(zhì)及膠體物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、鞣質(zhì)等?？刹捎媚し蛛x技術(shù)，根據(jù)聚合度不同將原花青素進(jìn)行分離。陳文良等［26］采用此法從葡萄子中分離低聚原花青素，所得含量高達(dá)65%。張娣等［27］研究發(fā)現(xiàn)，采用PAN膜-大孔樹脂聯(lián)用分離純化蓮房原花青素，得到的原花青素純度在81%以上，高于直接進(jìn)行大孔樹脂分離的63%。

2.3 高速逆流色譜

高速逆流色譜（High-speed counter-current chromatography，HSCCC）結(jié)合了液-液萃取和分配色譜的特點(diǎn)，是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)。王尉等［28］采用高速逆流色譜結(jié)合制備液相色譜法從葡萄子乙醇提取物中分離得到了8種多酚，其中原花青素B1、原花青素B2、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯和兒茶素的純度分別為98.5%、97.2%、98.3%、98.9%和96.7%。Zhang等［29］采用高速逆流色譜法，根據(jù)聚合度不同，有效地從葡萄子中分離出7個(gè)不同餾分的原花青素，其分離純度可高達(dá)95.7%。

3 原花青素的含量測定方法

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前原花青素的含量測定方法主要有鹽酸-正丁醇法、香草醛法、DMAC法、高效液相色譜法。

3.1 鹽酸-正丁醇法

鹽酸-正丁醇法又叫鐵鹽催化法，是根據(jù)原花青素在酸性條件下加熱轉(zhuǎn)化為紅色的花青素，其顯色原理為在正丁醇的鹽酸溶液中，F(xiàn)e3+為催化劑，在加熱的條件下，原花青素結(jié)構(gòu)單元之間的C-C鍵斷裂，末端單元以黃烷-3-醇形式解離，延伸單元生成碳正離子并繼續(xù)失去質(zhì)子生成黃烷-3烯-3醇，并被繼續(xù)氧化成在550 nm處有紫外吸收的花青素。該法具有專屬性，兒茶素、表兒茶素等結(jié)構(gòu)單體在該條件下不顯色，可排除該類物質(zhì)對(duì)顯色的干擾［30，31］。

3.2 香草醛法

香草醛法是目前使用最為廣泛的測定方法，其反應(yīng)原理為在強(qiáng)酸作用下香草醛能與原花青素類物質(zhì)A環(huán)上的間苯二酚或間苯三酚發(fā)生縮合反應(yīng)，在濃酸作用下（鹽酸或硫酸）生成在500 nm處有紫外吸收的有色的正碳離子，吸光度與濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)關(guān)系［32］。但是，該法不具專屬性，很多黃酮類化合物A環(huán)上也具有間苯二酚或間苯三酚結(jié)構(gòu)，原花青素一般是多聚體，1個(gè)分子中有多個(gè)活潑的A環(huán)與香草醛結(jié)合，因此，以兒茶素為對(duì)照品采用該法所測得的結(jié)果高于實(shí)際值。

3.3 DMAC法

對(duì)-二甲基氨基肉桂醛（DMAC）法，其反應(yīng)機(jī)理為DMAC在酸性條件下與黃烷醇發(fā)生脫水縮合，生成在640 nm處有紫外吸收的藍(lán)色產(chǎn)物，其顏色與濃度呈正比［33］。黃雪松等［34］以DMAC為顯色劑測定了山竹果皮、花萼和果肉中原花青素含量。該方法靈敏度比香草醛法高、速度快且專屬性強(qiáng)［35］。

3.4 高效液相色譜法

利用HPLC法測定反應(yīng)后產(chǎn)物的含量，即可測定原花青素的含量［36］。黃文燁等［37］采用硫解衍生法和RP-HPLC法對(duì)山竹殼中可提原花青素（EP）和不可提原花青素（NEP）進(jìn)行了測定，準(zhǔn)確測出竹殼中原青素的組成單元、含量和平均聚合度。張璐等［38］通過RP-HPLC法同時(shí)測定原花青素中兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素B2的含量，結(jié)果表明該方法具有簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)。

4 原花青素藥理活性

4.1 清除自由基及抗氧化活性

原花青素類物質(zhì)是一種以兒茶素或表兒茶素為主要結(jié)構(gòu)單元的多酚類聚合物，是一種天然的抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。據(jù)文獻(xiàn)記載，原花青素體內(nèi)的抗氧化能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍［39］。因?yàn)榫哂袃?yōu)異的抗氧化性能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、保健品、化妝品等領(lǐng)域［40］。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外抗氧化試驗(yàn)中，山楂原花青素在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基、DPPH自由基的清除率及總抗氧化能力顯著高于維生素C，且抗氧化能力與濃度呈正相關(guān)［41］。研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)產(chǎn)生過量的自由基是導(dǎo)致機(jī)體肝臟損傷、衰老及其他疾病產(chǎn)生的原因之一，葡萄子原花青素（GSPE）能夠通過提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激作用來緩解糖尿病小鼠基本情況，緩解腎臟損害［42］。張勍等［43］研究發(fā)現(xiàn)，夏黑葡萄花青素可通過調(diào)節(jié)衰老小鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的活性，清除衰老小鼠心肌細(xì)胞中的自由基，保護(hù)衰老小鼠的心肌細(xì)胞。

4.2 抗炎

炎癥本身是機(jī)體對(duì)外源刺激的一種防御或免疫反應(yīng)，但過度或持續(xù)性炎癥反應(yīng)會(huì)引發(fā)多種炎癥相關(guān)性疾病。全帥等［44］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄子低聚原花青素可以降低結(jié)腸組織中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)結(jié)腸組織中SOD水平，下調(diào)MDA水平，從而改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制NO、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)［45］。王青等［46］研究發(fā)現(xiàn)，原花青素B1和B2均能抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放，并能抑制NF-κB的磷酸化，且兩者作用強(qiáng)度無顯著差異。趙雅寧等［47］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄子原花青素可減輕慢性間歇性低氧大鼠腦組織炎癥反應(yīng)，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與抑制大鼠腦組織內(nèi)p38MAPK的活性和炎癥因子IL-1β的表達(dá)有關(guān)。

4.3 降血糖、降血脂

劉奇等［48］通過采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇滲漉提取，經(jīng)大孔樹脂層析，得到不同乙醇梯度葡萄子原花青素洗脫物，并采用高血脂大鼠模型對(duì)乙醇梯度洗脫物進(jìn)行降血脂藥效部位篩選，發(fā)現(xiàn)50%乙醇洗脫物能明顯降低高血脂大鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量，各乙醇梯度葡萄子原花青素洗脫物均可以促進(jìn)甘油三酯的代謝，提高肝臟代謝功能，抑制體內(nèi)脂質(zhì)的大量沉積，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，進(jìn)而起到降血脂作用。胡濟(jì)美等［49］通過高脂模型小鼠試驗(yàn)，對(duì)刺玫子原花青素進(jìn)行降血脂研究，發(fā)現(xiàn)刺玫子原花青素高劑量組（200 mg/kg）可以顯著降低高脂小鼠血清內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、甘油三酯含量，調(diào)節(jié)小鼠血脂代謝來達(dá)到降血脂的作用。劉靈等［50］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄子原花青素能緩解血清胰島素抵抗水平、修復(fù)損傷的β細(xì)胞、調(diào)節(jié)β細(xì)胞的增殖和凋亡等方面來調(diào)節(jié)糖脂代謝，對(duì)2型糖尿病患者有明顯的降血糖、降血脂作用，且不會(huì)對(duì)肝腎及造血功能造成不良影響。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，原花青素還可以通過提高機(jī)體抗氧化能力、降低炎癥因子對(duì)胰島細(xì)胞的損傷，調(diào)節(jié)血清的甘油三脂、總膽固醇和高密度脂蛋白達(dá)到降血糖和改善血脂的作用，如龍眼核原花青素［51］、昆山雪菊原花青素［52］、葡萄子原花青素［53］、松樹皮原花青素［54］。

4.4 抗癌、抗腫瘤

原花青素對(duì)癌癥、腫瘤具有一定的預(yù)防和治療作用，其作用機(jī)制主要有抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，調(diào)控分子信號(hào)通路NF-κB、MAPK、PI3K/AKT中的蛋白質(zhì)［55］。郭方明等［56］研究發(fā)現(xiàn)，葡萄子中的提取物原花青素可以誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制NF-κB通路中相關(guān)蛋白、活化Bax從而抑制PGE2、CRP的產(chǎn)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素B2可以通過下調(diào)PI3K/Akt通路中的p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表達(dá)誘導(dǎo)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬［57］。紅小豆中含有的原花青素，主要是兒茶素聚合物類組分對(duì)人體PC-3前列腺癌細(xì)胞具有顯著的抗癌活性，且他們還能通過抑制脂肪酸結(jié)合蛋白5基因的表達(dá)來控制前列腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［58］。

5 小結(jié)與展望

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，在健康狀態(tài)下，自由基是神經(jīng)傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)必不可少的重要介質(zhì)，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力等作用。但是在病理狀態(tài)或外界環(huán)境的刺激下，多余的自由基會(huì)破壞人體細(xì)胞，造成機(jī)體的一系列損傷。據(jù)文獻(xiàn)記載，與自由基有關(guān)的疾病多達(dá)70余種［59］。雖然在健康狀態(tài)下，人體能通過超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化氫酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、維生素C、維生素E等物質(zhì)清除體內(nèi)多余的氧自由基，維持體內(nèi)氧自由基的平衡。但是隨著年齡的增長，體內(nèi)這些物質(zhì)就會(huì)相應(yīng)減少。需要適當(dāng)補(bǔ)充維生素C等抗氧化物質(zhì)來維持機(jī)體氧自由基的平衡［60］。但是長期服用維生素C可能會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的危害，因此，需要不斷發(fā)掘不同的天然抗氧化物質(zhì)，開發(fā)各種類型抗氧化效果較好的產(chǎn)品。

當(dāng)歸藤是廣西少數(shù)民族民間常用藥物，具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血止血、祛風(fēng)止痛、舒經(jīng)活絡(luò)等功效［61，62］。當(dāng)歸藤中含有豐富的兒茶素、原花青素類成分，且含量較高。但是目前對(duì)于當(dāng)歸藤原花青素的研究較少，由于當(dāng)歸藤中原花青素的抗氧化能力強(qiáng)，極易在空氣中被氧化，給分離提取帶來較大的困難?？赏ㄟ^文獻(xiàn)調(diào)研，為當(dāng)歸藤提取分離純化、抗氧化研究，補(bǔ)血活血相關(guān)研究提供研究思路和方法。