熟雞肉中沙門氏菌生長模型的建立及貨架期預(yù)測

曾巧輝，余杏同，宋玉瓊，王敬敬，王思婷

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.華南食品安全研究發(fā)展中心，廣東 佛山 528225）

雞肉是沙門氏菌良好的天然載體。沙門氏菌被認(rèn)為是目前世界最重要的食源性致病菌之一［1］。其中鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等是污染禽肉類產(chǎn)品，進而引起人類食物中毒的主要致病菌［2］。因此，對雞肉開展常見售賣及食用溫度中沙門氏菌的預(yù)測微生物學(xué)模型研究，對更準(zhǔn)確的風(fēng)險評估非常重要。

近些年發(fā)展起來的微生物預(yù)報技術(shù)借助微生物數(shù)據(jù)庫和數(shù)學(xué)模型，能夠?qū)Ξa(chǎn)品中微生物的生長、存活和死亡進行快速預(yù)測［3］。有效的數(shù)學(xué)模型，可以在產(chǎn)品生產(chǎn)及品質(zhì)評價中建立一個客觀的標(biāo)準(zhǔn)，用來預(yù)測微生物的安全性和貨架期［4］。本實驗探究了不同恒溫條件下熟雞肉中沙門氏菌的生長趨勢，并預(yù)測了產(chǎn)品貨架期，以期為食品的安全風(fēng)險評估提供參考數(shù)據(jù)，以減少由于其污染而造成的食品安全問題。

微生物預(yù)測模型分為一級模型、二級模型和三級模型，一級模型主要描述微生物生長與時間的函數(shù)關(guān)系；二級模型主要表達環(huán)境如溫度對微生物生長的影響［5-7］。在預(yù)測微生物學(xué)中常用到的一級模型包括了Logistic 模型、Gompertz 模型和Baranyi 模型等。試驗采用Gompertz 模型及Logistic 模型，分別對5 個溫度條件下培養(yǎng)的沙門氏菌生長數(shù)據(jù)進行模擬，通過驗證比較選擇兩者中更適合的模型建立二級生長模型，描述溫度對沙門氏菌最大生長速率的影響。

三級模型結(jié)合一級模型與二級模型的數(shù)據(jù)，使用計算機程序做成微生物仿真軟件，以預(yù)測微生物生長趨勢。三級模型是一個全面的預(yù)測系統(tǒng)，如數(shù)個影響因素共同作用下的微生物變化情況等［8］。目前世界上已有多款成熟的預(yù)測軟件，如Combase 是預(yù)測微生物領(lǐng)域最完整的數(shù)據(jù)庫，是英國食品標(biāo)準(zhǔn)和食品研究協(xié)會、美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)機構(gòu)和下屬的東部地區(qū)研究中心以及澳大利亞食品安全中心聯(lián)合開發(fā)的［9］；SMAS 是一款冷鏈肉制品管理系統(tǒng)；SSSP 為海產(chǎn)魚類的剩余貨架期預(yù)測軟件等。通過預(yù)測微生物的生長趨勢，獲得重要生長特性參數(shù)，并在此基礎(chǔ)上建立剩余貨架期模型，有效動態(tài)預(yù)測產(chǎn)品的貨架期。另一方面，致病菌可能不會引起腐敗，但會引發(fā)食源性疾病，因此也必須嚴(yán)格控制致病菌在食品中的繁殖情況。在實際檢測中，預(yù)測產(chǎn)品的剩余貨架期往往要結(jié)合其他指標(biāo)，如微生物的品質(zhì)、感官評價、化學(xué)指標(biāo)等。近年來，為了輔助判斷貨架期，更好把控肉品的鮮度，氣味指紋技術(shù)應(yīng)運而生，以電子鼻分析技術(shù)和紅外光譜分析技術(shù)較為常見。預(yù)測模型在HACCP 分析及定量風(fēng)險評估中也必不可少。通過風(fēng)險評估得到各個階段的限值，動態(tài)監(jiān)測雞肉上沙門氏菌的數(shù)量，根據(jù)組合條件（PH、溫度等）獲得最低限值，幫助HACCP 控制雞肉產(chǎn)品質(zhì)量，預(yù)防微生物風(fēng)險。

貨架期指食品被貯藏在推薦的條件下，能夠保持安全，確保理想的感官、理化和微生物特性，保留標(biāo)簽聲明的任何營養(yǎng)值的一段時間［10］。建立貨架期預(yù)測模型，進行產(chǎn)品品質(zhì)的動態(tài)預(yù)報，對防止腐敗產(chǎn)品對消費者造成身體危害，對廠家和銷售商造成名譽損壞，提升肉類產(chǎn)品品質(zhì)控制水平具有十分重要的意義［11］。陳曉宇［12］將食品貨架期建模分為5 種方法，試驗采用基于微生物生長動力學(xué)的貨架期預(yù)測方法。為將微生物預(yù)測模型應(yīng)用到實際生產(chǎn)中，本文將得到的一級模型的生長特性參數(shù)運用到貨架期模型中，得到熟雞肉在實際貯存或消費溫度下的預(yù)測貨架期，并探討貨架期與不同參數(shù)之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及樣品

腸炎沙門氏菌（編號CM1.345）及鼠傷寒沙門氏菌（編號CM1.237），購自廣東省微生物菌種保藏中心；冷凍雞胸肉，購自廣東省佛山市獅山鎮(zhèn)陽光在線廣場好又多超市。

1.1.2 培養(yǎng)基

亞硫酸鉍BS 瓊脂，北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；無菌均質(zhì)袋等耗材，購自廣州文展實驗器材經(jīng)營部。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（FPOCH2 型），美國伯騰儀器有限公司北京代表處；生物安全柜（HR1200-IIA2 型），青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LWI-9160 型），上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZHTY-70S 型），上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；拍打式均質(zhì)器（ZGJZQ-10 型），上海梓桂儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-18SI 型），上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

將2 種菌粉活化后混合，將混合菌液加入胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)8～10 h，測定其吸光值使其在0.7～0.8。

1.3.2 供試雞肉的制備

從-20℃冰箱中取180 g 雞胸肉樣品置于常溫條件下解凍，切成18 小塊，每塊重10±0.1g，沸水煮5 min（沸騰后計時）后用漏勺撈起置于生物安全柜中晾至常溫，備用。

1.3.3 雞肉的接種、培養(yǎng)及計數(shù)

將切好的雞肉塊浸泡于菌液中（約為5～6 lg（CFU/mL）），置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中勻速振蕩30 min。振蕩后取出雞肉塊，瀝干菌液，并于生物安全柜中靜置20 min，使細(xì)菌均勻粘附于雞肉表面，最終雞肉接種濃度約為3～4 lg（CFU/g）。

將接種的雞肉塊用無菌均質(zhì)袋密封后分別置于4、8、16、25、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間，定時測定菌數(shù)。計數(shù)時，取一塊雞肉置于0.9%生理鹽水中，置于拍打式均質(zhì)器拍打。取1 mL 均質(zhì)液，用生理鹽水稀釋至不同濃度（稀釋倍數(shù)視菌數(shù)而定），取菌液在BS 平板上涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h 后計數(shù)。

1.3.4 一級模型的建立

使用Origin18.0 創(chuàng)建Gompertz、Logistic 2 種模型公式，其中Gompertz 模型［13］為

SLogistic 模型［14］為

式（1）、（2）中，t 為任意時刻，h；Nt為時間為t 時的菌數(shù)，lg（CFU/g）；N0為初始染菌數(shù)，lg（CFU/g）；μmax為最大比生長速率，lg（CFU/g）/h；λ 為遲滯期，h；A 為穩(wěn)定期時的菌數(shù)，lg（CFU/g）；a 為穩(wěn)定期微生物數(shù)量與初始染菌數(shù)的差值；k 為在時間Xc的相對生長速率（斜率）；Xc為達到相對最大生長速率所需的時間，h。

1.3.5 二級模型的建立

根據(jù)Ratkowsky 提出的經(jīng)典的平方根方程［15］建立二級模型。Ratkowsky 方程為

式（3）中，μma為最大比生長速率，lg（CFU/g）/h；t 為任意時刻，h；b 為斜率；tmin為當(dāng)沙門氏菌生長速率為0時的溫度，℃。

1.3.6 模型檢驗

試驗采用統(tǒng)計學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確因子Af、偏差因子Bf及均方根誤差（RMSE）來檢驗得到的模型。

式（4～5）中，U觀測值為試驗觀測的菌數(shù)，lg（CFU/g）；U預(yù)測值為擬合模型預(yù)測的菌數(shù)，lg（CFU/g）；n 為試驗觀測次數(shù)。

1.3.7 貨架期預(yù)測模型的建立

根據(jù)一級預(yù)測模型中得出的相關(guān)生長特性參數(shù)如μmax、λ 等，可直接帶入貨架期預(yù)測模型中。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定可知，產(chǎn)品的腐敗限量為4.699 lg（CFU/g），故將此數(shù)設(shè)為模型中的腐敗限量NS。貨架期預(yù)測模型［14］如下

式（7）中，N0為初始腐敗菌的對數(shù)值，lg（CFU/g）；Ns為最小腐敗菌數(shù)的對數(shù)值，4.699 lg（CFU/g）；Nmax為增加到穩(wěn)定期時最大的微生物數(shù)量對數(shù)值，lg（CFU/g）；μmax為最大比生長速率，lg（CFU/g）/h ；λ 為遲滯期，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 一級模型的建立

用Origin18.0 構(gòu)建的Gompertz 模型及Logistic 模型分別對8、16、25、35 ℃熟雞肉中沙門氏菌的生長曲線進行擬合，擬合后得出的生長參數(shù)最大比生長速率μmax（lg（CFU/g）/h）、遲滯期λ（h）及模型驗證因子如表1 所示，表1 中分別展示不同溫度下熟雞肉中沙門氏茵的Gompertz 模型及Logistic 模型擬合參數(shù)。其中由Logistic 模型擬合可得不同溫度下沙門氏菌的生長曲線圖，如圖1 所示。根據(jù)生長曲線圖可知8、16、25、35 ℃下熟雞肉中沙門氏菌的Logistic 模型公式，如表2 所示。

表1 熟雞肉中沙門氏菌的一級生長模型擬合參數(shù)

圖1 Logistic 模型擬合不同溫度下的生長曲線

表2 不同溫度下的Logistic 模型公式

2.2 二級模型的建立

將Logistic 模型擬合出各個溫度下的μmax代入式（3）Ratkowsy 方程，進行擬合，得到沙門氏菌生長速率與溫度的二級模型。模型方程式為

根據(jù)模型方程式可得不同溫度與最大比生產(chǎn)速率間的關(guān)系，如圖2 所示。由表3 可知，Gompertz 模和Logistic 模型分別采用Ratkowsy 模型擬合后的相關(guān)參數(shù)間的對比，可知Logistic 模型擬合度更高，決定系數(shù)R2為0.964 11。

圖2 Ratkowsy 模型擬合溫度與最大比生長速率的關(guān)系

表3 Ratkowsy 模型擬合相關(guān)參數(shù)

2.3 貨架期預(yù)測模型的建立

在恒溫條件下，根據(jù)模型預(yù)測獲得的貨架期及貨架期與不同參數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)如表4～5。

表4 不同溫度條件下的熟雞肉貨架期

表5 中，N0為初始腐敗菌的對數(shù)值，lg（CFU/g）；μmax為最大比生長速率，lg（CFU/g）/h；λ 為遲滯期，h。

表5 熟雞肉貨架期與不同參數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論與討論

目前，市面上售賣的散裝雞胸肉產(chǎn)品主要分為常溫和冷凍兩種形式。人們在購買之后一般選擇直接進行烹飪或置于冰箱中冷藏。由于食用前放置熟雞肉的溫度范圍較廣，且放置時間不一，在任意過程中均存在污染沙門氏菌的風(fēng)險，本試驗探究的溫度涵蓋了人們食用熟雞肉的溫度范圍，分別在4、8、16、25、35 ℃探究沙門氏菌的生長情況。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，4 ℃條件下的沙門氏菌并無明顯生長；觀察5 d后，菌數(shù)由4.605 lg（CFU/g）下降至2.477 lg（CFU/g）。這與孫婷婷［16］、FANG［17］等人的研究結(jié)果一致。唐曉陽［11］認(rèn)為，4 ℃以下的溫度能減緩樣品變質(zhì)速率。低溫降低了微生物體內(nèi)酶活性，抑制其生長速率，延長增殖適應(yīng)期［18］。在此溫度下的沙門氏菌或許能夠存活，但無法正常增殖；且隨著時間的延長，菌數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢。

一級生長模型無法擬合4 ℃條件下沙門氏菌的生長曲線，故只對其他4 個溫度進行擬合。一級生長模型擬合生長曲線，主要得到兩個重要的生長特性參數(shù)：最大比生長速率μmax和遲滯期λ。μmax越大，說明環(huán)境越適合細(xì)菌生長，貨架期越短。遲滯期表示細(xì)菌適應(yīng)新環(huán)境的過渡階段。遲滯期越長，說明細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境并增殖的時間越長，越有利于貯藏，貨架期也越長。試驗結(jié)果顯示，在8～35 ℃，沙門氏菌能夠在雞肉上以S 形曲線正常生長，且隨著溫度的逐漸升高，生長速率逐漸增大，遲滯期逐漸減小，且到達穩(wěn)定期的菌落總數(shù)均在8～9 lg（CFU/g）（8 ℃除外）。表明溫度影響細(xì)胞的生長過程，即進入對數(shù)期的時間，而對最終菌數(shù)并無決定性影響［11］。從圖1 可以看出，在8 ℃和16 ℃時，沙門氏菌生長緩慢，16 ℃時生長達到穩(wěn)定期需要80 h，遲滯期λ為5.8 h；在25 ℃時，沙門氏菌的生長速率明顯加快，達到穩(wěn)定期需要20 h，λ為3.3 h；35 ℃時只需要10 h 即可達到穩(wěn)定，λ為1.7 h。

Gompertz 模型、Logistic 模型、Baranyi 模型是預(yù)測微生物學(xué)中最普遍也是最常用的3 種一級生長模型。這3 種一級模型描述的生長曲線符合微生物的生長趨勢，且能夠直接得到微生物相關(guān)生長參數(shù)如遲滯期及最大比生長速率，成為預(yù)測微生物應(yīng)用最為簡單有效的方程［19］。一級模型通常使用在影響因素單一時對微生物的預(yù)測［20］。而Logistic 模型和Gompertz 模型適合描述適溫條件下微生物的生長［21］。本試驗發(fā)現(xiàn)Logistic 模型和Gompertz 模型擬合效果甚佳。Baranyi 模型雖然也能很好得擬合一級模型，但在二級模型中的擬合度較差，為0.603 4，故僅選擇其他兩種模型進行擬合度對比。結(jié)果顯示，兩種模型在不同溫度下的擬合系數(shù)幾乎都達到了0.99。且logistic 模型的生長特性參數(shù)與相關(guān)文獻數(shù)據(jù)更接近，其R2也更高，故認(rèn)為Logistic 模型為該試驗條件的最佳一級模型。

Af越接近于1，模型預(yù)測準(zhǔn)確性越高。對Bf來說，0.90＜Bf＜1.05，模型為最佳［22］。均方根誤差RMSE值越小，模型擬合度越高。由表1 可知，Logistic 模型準(zhǔn)確因子Af在8、16、25、35℃分別為1.008 1、1.054 4、1.016 3、1.010 6，非常接近1；偏差因子Bf分別為0.990、0.991 8、0.997 3、0.996 3，表明擬合效果佳；均方根誤差分別為0.028 2、0.187 5、0.131 4、0.076 3，非常小。觀測值接近預(yù)測值，模型擬和較佳。

二級模型中，平方根模型（包括Ratkowsy 模型）簡便精確，是溫度影響微生物生長的最佳溫度經(jīng)驗方程式，對混合菌株或單一菌株皆適用，運用廣泛［4］。在二級模型的擬合中發(fā)現(xiàn)，Ratkowsy 模型能夠較好地擬合該試驗條件下溫度與最大比生長速率的關(guān)系，擬合系數(shù)為0.964 1，預(yù)測的最低生長溫度為-0.63 ℃。在同一二級模型擬合中，孫婷婷［16］得出在新鮮雞肉上沙門氏菌的最低生長溫度為1.78 ℃；FANG［17］在生蠔中得出的最低生長溫度為1.87 ℃。FANG 指出，在與其他二級模型預(yù)測的最低生長溫度值相比，Ratkowsy 模型的預(yù)測值偏低。實際在冷鏈運輸過程或貨架擺放時，因各種因素導(dǎo)致溫度浮動的現(xiàn)象非常普遍，這就給微生物生長繁殖提供了可能性。試驗發(fā)現(xiàn)，測定的不同溫度下沙門氏菌在熟雞肉上的生長速率比其他文獻的研究結(jié)果［23-25］大?？赡苁且驗殡u肉煮熟后，蛋白質(zhì)更容易被消化，營養(yǎng)物質(zhì)更容易被吸收，更有利于沙門氏菌的生長繁殖。另外，有報道稱［26］，自然微生物可一定程度上抑制沙門氏菌的生長。本試驗采取滅菌后再接菌的方法，消除了自然微生物對沙門氏菌的干擾。以上原因皆可能導(dǎo)致本試驗測定的生長速率快于其他文獻結(jié)果。

利用貨架期預(yù)測模型，在該試驗條件下預(yù)測了8、16、25、35 ℃等4 個溫度下的貨架期，分別為10.794 4、9.153 7、4.099 3、1.723 6 h，見表4。貨架期終點菌數(shù)為國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的4.699 lg（CFU/g）。試驗接種菌量在3～4 lg（CFU/g），接近正常情況下熟雞肉上的天然菌落總數(shù)。從預(yù)測貨架期結(jié)果看，即使在8℃環(huán)境下，沙門氏菌的生長速率也比想象要快，僅需要約11 h 即可超過安全標(biāo)準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)室溫下，熟雞肉的貨架期只有4 h；一進入夏季高溫，貨架期幾乎就是從購買到回家立即食用的時間。故建議應(yīng)盡量購買冷凍生雞肉，減少購買常溫雞肉，且購買回家后應(yīng)立即煮熟并食用，按需烹飪，剩余廢棄；非立即食用應(yīng)及時放入冰箱冷凍層；也可選擇購買真空包裝熟雞肉，盡量不要購買熟食柜中存放過久的熟雞肉，選擇購買新鮮出爐的熟雞肉，且購買回家加熱后食用。

試驗探究了熟雞肉貨架期與不同參數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其與最大比生長速率、遲滯期及初始菌數(shù)等存在一定的相關(guān)性。由表5 可知，貨架期與遲滯期λ 相關(guān)性最高，為0.993 1，且與其呈正相關(guān)；與最大比生長速率μmax呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.992 6；與初始菌數(shù)相關(guān)性最低，僅0.269 4。本試驗中，所有的熟雞肉皆為接種染菌，菌數(shù)均處于3～4 lg（CFU/g），較為一致，故導(dǎo)致了初始菌數(shù)與貨架期的相關(guān)性不強。但實際上，初始菌數(shù)是影響貨架期的主要因素之一，一般初始菌數(shù)越大，達到貨架期終點的時間越短。其他參數(shù)中，遲滯時間對貨架期的影響最大。遲滯時間越長，貨架期也越長。最大比生長速率μmax表述生長曲線的凹凸點變化處切線的正切數(shù)值［27］；數(shù)值越大，說明細(xì)菌在指數(shù)增長期的最大生長速 率越大，細(xì)菌的生命活動旺盛，貨架期越短。總之，最大比生長速率與遲滯期是特定微生物在特定環(huán)境下的特性，與初始菌數(shù)共同影響產(chǎn)品的貨架期。