煙草靶斑病致病機理及防治技術(shù)研究進展

鄧瀏平，陳怡璇，傅雪平，周 毅，羅真華，劉怡軒，王 旋，張 陽

（株洲市煙草公司茶陵縣分公司，湖南 茶陵 412400）

煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，全球約有120個國家和地區(qū)種植煙草。病害是影響煙草產(chǎn)質(zhì)量的主要因素之一。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)煙草病害約116種，其中侵染性病害達79種，真菌病害有38種[1]。煙草靶斑?。═obacco target spot）是由瓜亡革菌引起的一種真菌性病害，1948年在巴西首次報道，此后在哥斯達黎加、美國北卡羅來納州等地區(qū)嚴重發(fā)生，給當?shù)胤N植戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2-3]。該病害2006年在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并被報道，從煙草苗期至大田成熟期均可發(fā)生，侵染葉片的同時還危害莖部。葉片受侵染后出現(xiàn)圓形水漬狀斑點，如遇溫度適宜、濕度大的環(huán)境，病斑則迅速擴展形成直徑2～20 cm有同心輪紋的不規(guī)則斑，病斑周圍有褪綠暈圈，病斑壞死部分易碎，形成穿孔，類似槍彈射擊在標靶上形成的空洞，故稱為靶斑病[4]。該病是我國近年來發(fā)生范圍較廣的一種病害，在遼寧丹東、云南普洱等地發(fā)生較為普遍，且來勢猛、流行快，連片發(fā)生、病情重，極大地影響烤煙產(chǎn)質(zhì)量，同時具有一定的傳染性，是煙草大田期應(yīng)重點關(guān)注的病害之一[5]。為了降低該病害對煙葉生產(chǎn)造成的不良影響，提高防治效果，近年來，廣大研究人員在靶斑病生物學(xué)特性、致病性及防治對策等領(lǐng)域做了大量細致的研究，綜述以往研究進展可以為生產(chǎn)上科學(xué)防治煙草靶斑病提供指導(dǎo)。

1 煙草靶斑病病原菌鑒定

研究表明，導(dǎo)致煙草靶斑病發(fā)生的無性病原菌為立枯絲核菌，是一種無性類真菌，屬絲孢綱無孢目絲核菌屬[6]；細胞為多核，菌絲呈褐色，粗壯有分隔，直徑為 8～12 μm。該病病原菌的有性世代為瓜亡革菌，屬擔(dān)子菌門層菌綱無隔擔(dān)子菌亞綱膠膜菌目亡革菌屬；子實體為扁平狀，奶油色至灰白色，平均大小9 μm×5.5 μm；擔(dān)孢子表面透明光滑，呈橢圓形至球形，大小為 6～14 μm×4～8 μm，頂生2～4個小柄。靶斑病病原菌主要危害煙草種子、下胚軸及根部，Gutierrez等[7]研究認為，該病原菌也能夠侵染葉片、莖稈等地上部分。該病害的癥狀表現(xiàn)易與生產(chǎn)上常見的赤星病、野火病的病癥混淆，造成誤診。

2 煙草靶斑病的致病機理

2.1 煙草靶斑病病原菌的生物學(xué)特性

相關(guān)研究表明，適中的溫度、較高的相對濕度以及葉片長時間濕潤等條件有利于煙草靶斑病的發(fā)生。近年來，國內(nèi)發(fā)病較重的區(qū)域均出現(xiàn)過連續(xù)降雨、田間長時間灌水等不利環(huán)境因素。田間空氣相對濕度大，局部氣溫偏低，也有利于病原菌的侵染與傳播。

劉欣茹等[8]對病原菌形成的環(huán)境條件進行了研究，運用溫濕度自動記錄儀監(jiān)測田間環(huán)境條件，并收集田間擔(dān)孢子回接，采取融合群鑒定和分析 ITS 序列的方法明確了引起煙草靶斑病的病原菌歸屬為立枯絲核菌 AG-3；其研究發(fā)現(xiàn)田間擔(dān)孢子主要在5：00—9：00及20：00—23：00這2個時間段形成，擔(dān)孢子形成的適宜環(huán)境溫度為20 ℃左右，相對濕度100%。接種試驗發(fā)現(xiàn)擔(dān)孢子可快速侵染煙草葉片形成靶斑病病斑，而且擔(dān)孢子的數(shù)量大、重量輕，可通過田間氣流快速傳播，導(dǎo)致病害廣泛蔓延，空氣氣流傳播是病原菌侵染的主要路徑。

伏穎等[9]對煙草靶斑病原菌侵染部位及特性進行了人工接種研究，發(fā)現(xiàn)病原菌既可侵染不同生長階段的煙草葉片，也可侵染葉片主脈、側(cè)脈及成株期近土表的莖基部，出現(xiàn)立枯、莖基腐及典型靶斑癥狀。接種時間對病原菌侵染影響較大，時間越長侵染率越高，接種6 h即可引發(fā)煙草病害，接種24～48 h菌絲迅速擴展，侵染率達80%以上，最終導(dǎo)致細胞死亡。影響病原菌侵染最主要的環(huán)境因素是溫濕度，溫度在15～35℃內(nèi)均可侵染，最佳侵染溫度為25～30℃，高濕及連續(xù)黑暗都有利于病原菌侵染。

吳元華等[10]采用柯赫氏證病規(guī)則進行接種試驗，確定引起煙草靶斑病的病原物為瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk]，無性世代為立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）；生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，適宜菌絲生長的溫度范圍在20～30℃，菌落直徑大于50 mm，最適溫度為25℃，菌落直徑達65.35 mm，最適pH值為7，菌落直徑和生長速率均達到最大值。高濕度、黑暗條件對菌絲生長有利，相對濕度為65%～90%時，均適宜于菌絲生長，最適宜于菌核萌發(fā)的相對濕度為90%。

2.2 煙草靶斑病病原菌的致病力研究

細胞壁是植物抵抗病原真菌侵入與擴展的屏障。病原菌在侵染過程中產(chǎn)生的細胞壁降解酶能突破這一障礙，成為主要致病因子，其中多聚半乳糖醛酸酶在真菌致病過程中起著主要作用。趙艷琴等[11]對煙草靶斑病病原菌細胞壁降解酶的活性變化、產(chǎn)酶的條件及其對葉片的損傷情況進行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，人工培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的細胞壁降解酶達6種，其中多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）與羧甲基纖維素酶（Cx）活性較高；在煙草組織活體內(nèi)和體外，病原菌所產(chǎn)酶的活性表現(xiàn)出一定差異，在組織活體外以PG和PMG活性最高，在組織活體內(nèi)以Cx和β-葡萄糖苷酶的活性最高；強致病力菌株的產(chǎn)酶能力要高于弱致病力菌株；病原菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶能夠損傷煙草葉片并引起與病害相似的癥狀，在致病過程中，果膠酶與混合酶共同對細胞膜造成損傷從而引起植株發(fā)病。

趙艷琴等[12]克隆了煙草靶斑病病原菌強弱致病力菌株的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（endoPGs），分析其全長cDNA 序列及表達特性發(fā)現(xiàn)，煙草靶斑病原菌強致病力菌株（YC-9）與弱致病力菌株（LF-2）的endoPGs基因均具有PLNO3003基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，強弱致病力菌株的推測蛋白均與煙草靶斑病病原菌致病蛋白的同源關(guān)系較近，且endoPG1和endoPG2推測蛋白的同源性也較高。endoPGs基因的表達受煙草互作的誘導(dǎo)，在不同致病力菌株中存在明顯差異。在互作過程中強致病力菌株可迅速大量地合成endoPGs酶，病原菌侵染初期要比弱致病力菌株的表達量大，從而表現(xiàn)出發(fā)病迅速、病情更重的特點。

RNAi技術(shù)具有高特異性、高效穩(wěn)定的優(yōu)點，已成為煙草病害領(lǐng)域的重要研究工具。郭依等[13]通過雙鏈RNA的表達與抗病性分析，利用T7 RNAi逆轉(zhuǎn)錄試劑盒體外轉(zhuǎn)錄靶向煙草靶斑病病原菌RPMK1基 因 和endoPGs基 因 的dsRNA-RPMK1和dsRNAendoPGs，構(gòu)建了基于pTRV-RPMK1和pTRV-endoPGs的VIGS沉默體系，屬VIGS首次應(yīng)用于煙草靶斑病研究。其研究發(fā)現(xiàn)，在24、48、72 h 這3個時間點上dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs均對煙草靶斑病病原菌的菌絲生長有抑制作用，其中dsRNA-RPMK1和dsRNA-endoPGs在48 h時對煙草靶斑病病原菌菌絲生長的抑制率分別為44.03%和50.49%，抑制作用最好。

蘇燕妮等[14]通過PCR技術(shù)分離了煙草抗病基因的同源序列，分析了受靶斑病病原菌侵染葉片的TRGA8、TRGA1基因同源序列的表達趨勢及表達量差異，研究表明，不同抗病性的煙草品種，在24 h內(nèi)其抗病基因同源序列的相對表達量變化趨勢是相同的，在24 h之后則表現(xiàn)出較大差異。煙草靶斑病的抗病表現(xiàn)與TRGA8基因序列相關(guān)，TRGA8基因序列的下調(diào)表達是防止煙草被靶斑病病原菌侵染與擴展的關(guān)鍵原因。

2.3 煙草靶斑病病原菌的致病力分化與遺傳變異特性

在自然環(huán)境中立枯病病原菌經(jīng)常會出現(xiàn)致病力分化的現(xiàn)象，根據(jù)抗感反應(yīng)情況可劃分為強、中、弱3種致病類型。致病力分化是多重因素共同作用導(dǎo)致的。例如：菌絲融合產(chǎn)生了異核現(xiàn)象；或是立枯絲核菌有性繁殖產(chǎn)生了擔(dān)孢子，提高了菌株間基因重組的頻率，致使菌株致病力變異。

簡單重復(fù)序列擴增（ISSR）是常用的分子標記方法之一。趙秀香等[15]通過ISSR分子標記方法，對煙草靶斑病病原菌進行遺傳多樣性分析，其研究表明煙草靶斑病致病菌株間的遺傳分化程度較高，存在較豐富的遺傳變異。聚類分析顯示，同一地區(qū)的菌株親緣關(guān)系較近、遺傳分化程度較低，而不同地區(qū)的菌株親緣關(guān)系較遠、遺傳分化程度較高；也存在同一地區(qū)菌株未能聚集在同一遺傳聚類群中的情況，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性；ISSR 遺傳聚類組群與菌株的致病性無明顯的相關(guān)性，與菌株的地理來源存在一定的相關(guān)性。

趙艷琴等[16-17]建立了煙草靶斑病病原菌遺傳多樣性分析的反應(yīng)體系，研究了其SRAP分組與菌株地區(qū)來源及致病類型之間的關(guān)系，結(jié)果表明，SRAP分組與致病類型劃分存在明顯相關(guān)性，而與地區(qū)來源及融合群劃分沒有明顯的相關(guān)性；該研究還對煙草靶斑病的致病力進行了測定，以K326、VGR2和G80等煙草不同抗感品種為鑒別寄主，將遼寧煙草靶斑病病原菌劃分為強致病類型I、弱致病類型III和中等致病類型II，結(jié)果顯示，遼寧煙草靶斑病病原菌表現(xiàn)出較為明顯的致病力差異，在遼寧產(chǎn)區(qū)以中等致病類型菌株為優(yōu)勢種群，致病類型差異與地區(qū)來源之間的相關(guān)性不明顯。

3 煙草靶斑病的防治技術(shù)研究

3.1 抗病品種篩選

選育抗病品種是防治煙草靶斑病的有效措施。蘇燕妮等[18]運用離體葉片接種法鑒定評價了我國21個煙草主栽品種對靶斑病的室內(nèi)抗性，結(jié)果表明，這21個主栽品種中沒有對煙草靶斑病病原菌免疫或抗病的煙草品種，NC297、龍江981品種對來自黑龍江、吉林、遼寧3個省份的強致病力菌株表現(xiàn)中抗，云煙97、中煙202、NC55、G28和KRK26對不同地區(qū)的菌株表現(xiàn)出中抗。KemySeebold[19]研究發(fā)現(xiàn)，煙草靶斑病在KY14×L8、NC BH129和NC2000品種上的發(fā)病程度要輕于NC5、NC7和KT204品種。王萬能[20]研究則認為，在全國推廣的煙草品種中，以NC89、G80和K326的綜合抗性較好。從目前國內(nèi)外研究情況來看，所有煙草品種均可感染靶斑病。基于此，要廣泛收集抗性資源，引用更多的抗性基因，以加強抗靶斑病煙草品種的選育。

3.2 農(nóng)業(yè)防治

遲春高[21]研究了煙草主要真菌病害的防治措施，認為煙草育苗苗床應(yīng)遠離工廠，避免廢氣、廢水危害，也要遠離農(nóng)田以及煙草種植區(qū)域，避免農(nóng)藥化肥及種植區(qū)域殘余病原菌對幼苗的侵染與危害。孫宏宇[22]研究認為，苗期控制靶斑病病害可大大減少大田期的損失，合理控制苗床溫濕度，做好苗棚、漂盤等的消毒，可有效減少土壤和苗床周圍的病毒量。

Shew等[2]研究發(fā)現(xiàn)，科學(xué)的栽培管理措施，保持良好的衛(wèi)生和通風(fēng)條件，特別是合理把握氮肥施用量是防治煙草靶斑病的有效手段。煙草大田生長期缺乏氮肥時，會增加靶斑病的發(fā)病概率，低氮肥水平下葉片組織更容易形成病灶，發(fā)展為嚴重的靶斑病癥狀。煙株氮素含量低于50 mg/kg時，會導(dǎo)致靶斑病大面積爆發(fā)。但施用過多氮肥，容易造成煙株前期生長過旺，形成群體間通風(fēng)不良的高濕度環(huán)境，有利于靶斑病的早期侵染和蔓延擴散。

3.3 生物防治

黃宇祥等[23]從不同煙田土壤中篩選出對羥基苯甲酸降解菌，并研究了其與煙草根際、靶斑病病原菌、煙株之間的互作效應(yīng)，研究采用自毒物質(zhì)降解菌A1、靶斑病拮抗菌B1、A1+B1組合3種有益菌處理模式，通過拌母床土、拌母床土+蘸根假植、拌假植土3種方式將有益菌接種到煙株根系，考察不同處理煙株靶斑病的自然發(fā)病率及病情指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合有益菌處理方式對煙草靶斑病的抑制效果優(yōu)于單一菌種處理，而有益菌不同施用方式中以拌假植土處理對煙草靶斑病的抑制效果最好。

莽春霞等[24]從遼寧丹東煙草靶斑病發(fā)病較重區(qū)域采集土壤樣品，以靶斑病病原菌作為供試菌，篩選出具有明顯拮抗作用的生防鏈霉菌128菌株，經(jīng)抑菌活性測定，靶標病原菌的抑菌圈直徑可達14 mm，抑菌率為66%；同時，該研究還通過田間試驗研究了生防鏈霉菌S128和多種生防菌劑對煙草靶斑病病原菌的防效，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌與生防鏈霉菌S128對煙草靶斑病的防效均達85%以上，差異不顯著，對照的化學(xué)藥劑防效在50%左右，表明利用生防菌劑防治煙草靶斑病的效果更好。

冉曉敏等[25]研究了枯草芽孢桿菌GH18和GH19這2種生物防治藥劑對立枯絲核菌的抑菌效果，結(jié)果顯示，2種生物防治藥劑處理的立枯絲核菌菌落生長均受到了抑制，且抑制作用均較強，同時生物制劑還具備易生產(chǎn)、無污染的特點，應(yīng)用前景廣闊。

3.4 化學(xué)防治

王左斌等[26]通過田間試驗研究了嘧肽菌凈對煙草靶斑病的防效，發(fā)現(xiàn)6%的嘧肽菌凈水劑對煙草靶斑病原菌具有較好的防治效果，嘧肽菌凈600倍液對煙草靶斑病的相對防效達85.33%，與750倍液的甲基托布津防治效果相當，優(yōu)于三唑酮等化學(xué)藥劑；進一步研究發(fā)現(xiàn)，嘧肽菌凈可以充分抑制煙草靶斑病病原菌的菌絲生長，破壞菌絲細胞而使其致畸，最終導(dǎo)致菌絲原生質(zhì)凝聚，內(nèi)含物嚴重外滲。

司洪陽等[27]測定了5種不同濃度的1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病原菌的防治效果，結(jié)果表明，45.00 mg/L的1.8%嘧肽·多抗水劑對煙草靶斑病病原菌菌絲生長的抑制率達到了100%，處理后的菌絲出現(xiàn)了畸形、斷裂情況，表現(xiàn)出較好的抑制作用。

伏穎[28-29]在我國首次研究并確定引起煙草靶斑病的立枯絲核菌屬AG-3融合群，同時他還研究了10種藥劑對煙草靶斑病病原菌的室內(nèi)抑菌效果，結(jié)果表明，烯哇醇、菌核凈、嚓膚菌凈、退菌特和代森錳鋅對煙草靶斑病病原菌具有較強的抑制作用，并且隨著藥劑濃度的升高抑菌作用增強，其中代森錳鋅與菌核凈的抑菌作用較優(yōu)，抑菌率高達100%，可作為煙草靶斑病病害防治的首選藥劑。

周建全等[30]研究了12種不同藥劑對煙草靶斑病病原菌的室內(nèi)抑菌效果和田間防治效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%井岡霉素和20%噻氟酰胺（滿穗）SC等9種藥劑的室內(nèi)抑制效果較好，田間試驗也以10%井岡霉素和20%噻氟酰胺（滿穗）SC表現(xiàn)較優(yōu)，對靶斑病病原菌的相對防效達到70% 以上，可以作為推薦藥劑。

王潮鐘等[31]研究了15種防治藥劑對煙草靶斑病的防治效果，從田間藥效來看，30%苯甲·丙環(huán)唑乳油（愛苗）和20%噻氟酰胺SC（滿穗）的相對防效分別達到了76.95%和72.33%，且這2種藥劑對煙草靶斑病的防治效果見效較快且藥效持久，可作為田間防治的推薦藥劑。

劉斯泓等[32]從10種煙草靶斑病防治待選原藥中篩選了2種較優(yōu)試劑進行復(fù)配試驗，并進行劑型配方研究，發(fā)現(xiàn)惡霉靈、腐霉利防效明顯優(yōu)于其他原藥，以50%腐霉利·惡霉靈800倍液田間防治效果最好，相對防效達到60.03%。

4 展 望

農(nóng)業(yè)防治是煙草大田生產(chǎn)病害控制的基礎(chǔ)，要做好煙草靶斑病的防治，需要管理人員及種植主體按照“預(yù)防為主、綜合防治”的思路，在溫度適宜且降雨頻繁的季節(jié)，加強生產(chǎn)干預(yù)，以達到病害防治的理想效果。需重點從幾個方面著手。第一，選育抗靶斑病品種。種植抗病品種是防治病害最經(jīng)濟有效的方法，在煙草病害中，抗病性強的品種，田間病害發(fā)生程度要低于非抗病品種。第二，要深耕曬垡、撒生石灰。土壤消毒可有效殺滅病原菌[33]。第三，加強煙田衛(wèi)生管理，預(yù)防田間病害傳染。移栽后要經(jīng)常檢查煙田病害情況，發(fā)現(xiàn)少量或零星病株時，及時清理出田間，并對周圍進行施藥保護，對發(fā)病的中心進行病原菌消殺[34]。第四，針對區(qū)域病害發(fā)生時期與特點，科學(xué)選擇藥劑，合理控制施藥量，防止盲目用藥，提高防治效果。

目前，國內(nèi)對煙草靶斑病的防治研究仍以化學(xué)藥劑防治為主，取得到了一定的成效，但化學(xué)藥劑防治雖然防效顯著，卻容易使病原菌產(chǎn)生抗性，同時對植煙環(huán)境會造成一定污染，不符合煙草生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的要求。因此，要加大非化學(xué)防治手段的研究力度。例如有益微生物及抗生素物質(zhì)已經(jīng)在赤星病、黑脛病等病害防治中展示出良好的成效[35]。今后煙草靶斑病的防治研究應(yīng)從基因工程、物理防治、生物防治等方面繼續(xù)深入，形成更加系統(tǒng)有效的防治手段，有效控制煙草靶斑病病原菌的侵染與傳播，從而提高煙草種植產(chǎn)質(zhì)量，保障生產(chǎn)效益。