馬齒莧總黃酮改善小鼠非酒精性脂肪肝的作用

姚瑞強(qiáng)，宋維芳，胡鑫麗，張文慧

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，汾陽 032200)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由除酒精以外的其他明確的損傷肝臟因素導(dǎo)致的，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性和肝細(xì)胞內(nèi)三酰甘油(triglyceride，TG)蓄積過多為顯著特征的臨床病理綜合征[1]。化學(xué)藥物對(duì)NAFLD的治療作用有限，大多數(shù)降脂藥可導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[2]。因此，尋找有效治療NAFLD的藥物并研究其機(jī)制非常必要。馬齒莧是一年生肉質(zhì)草本藥食同源植物[3]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫力等多種作用[4-7]。馬齒莧含有黃酮類、生物堿類和萜類等多種化學(xué)成分[8-9]，其中黃酮類化合物具有豐富的藥理作用，在抑菌和抗腫瘤方面的研究報(bào)道較多[10]。本研究的考察重點(diǎn)是馬齒莧總黃酮(portulaca oleracea total flavones，POTF)對(duì)NAFLD小鼠脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠NAFLD模型的構(gòu)建及分組4～6周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠40只，購買并喂養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量17～22 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組(每組8只)：對(duì)照組、NAFLD組、POTF 2.5 mg/kg組、POTF 5 mg/kg組、POTF 10 mg/kg組。對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其他4組每天給予高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)POTF 2.5 mg/kg組、5 mg/kg組、10 mg/kg組小鼠分別以溶解于0.5 mL的2.5、5、10 mg/kg POTF灌服，對(duì)照組和NAFLD組小鼠灌服等容量0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)4周。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 在給藥第4周末使小鼠禁食水10 h，次日麻醉，剖腹分離并暴露腹主動(dòng)脈，取血0.5 mL，4 ℃靜置24 h，以1 000 ×g離心10 min分離上層血清，分裝，待測(cè)或-20 ℃保存。采用脫頸椎處死法處死小鼠，立即摘取其肝臟，用濾紙吸干血液。取肝左外側(cè)葉置4%多聚甲醛中固定，待H-E染色。另取肝右外側(cè)葉1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小立即冰凍切片，自然晾干后待紅油O染色。然后，取肝臟組織約200 mg放入凍存管，置冰盒中-80 ℃保存。

1.3.2 血清生化指標(biāo)和空腹血糖的測(cè)定 取上述“1.3.1”項(xiàng)采集的血清進(jìn)行檢測(cè)。使用HITACHI 7600型全自動(dòng)生化分析儀，采用連續(xù)檢測(cè)法測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)，采用酶法測(cè)定TG，采用己糖激酶法測(cè)定空腹血糖。

1.3.3肝損傷的H-E染色觀察 用二甲苯脫蠟組織切片，進(jìn)行2次，每次10 min。依次在100%、90%、80%、70%乙醇中各浸泡3 min。用蘇木精染色2 min，1%鹽酸乙醇分化10 s，稀氨水返藍(lán)20 s，伊紅染色3 min。以上每個(gè)步驟處理后均用去離子水沖洗3次，每次各1 min。再依次經(jīng)過70%、80%、90%、100%乙醇脫水，每個(gè)梯度各5 min。二甲苯透明2次，每次10 min，之后用中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.3.4 脂質(zhì)堆積的油紅O染色觀察 用PBS洗滌切片3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗滌3次，60%異丙醇潤洗10 s，加入0.3%油紅O染色液染色1 min，再經(jīng)60%異丙醇漂洗及PBS漂洗3次，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 脂代謝標(biāo)志物的Western blotting檢測(cè) 取上述“1.3.1”項(xiàng)儲(chǔ)存的組織約100 mg，采用全蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離組織中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%BSA封閉后，用一抗(CPT-1、ACC)在4 ℃孵育過夜。然后將膜與二抗在室溫下孵育45 min。最后，用ECL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)條帶。信號(hào)通過Image Lab v 3.0軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 氧化應(yīng)激相關(guān)分子的試劑盒檢測(cè) 取上述“1.3.1”項(xiàng)保存的血清進(jìn)行檢測(cè)。采用可見分光光度法檢測(cè)SOD活性及MDA、GSH水平，根據(jù)試劑盒使用說明進(jìn)行操作。

1.3.7 肝組織中IL-6和IL-10水平的ELISA檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6和IL-10的水平，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。按照組織質(zhì)量(g)∶提取液體積(mL)為1∶5～1∶10的比例(建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿；以8 000 ×g4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。向包被微孔中依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。在所有孔中加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，最后加入終止液50 μL。使用多功能酶標(biāo)儀(Multiskan Sky，Thermo Fisher公司)檢測(cè)光密度[D(450 nm)]值。

2 結(jié)果

2.1 POTF對(duì)NAFLD小鼠血清生化指標(biāo)和空腹血糖的影響與對(duì)照組比較，NAFLD組的ALT、AST、TG和空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)。與NAFLD組比較，POTF 2.5 mg/kg組、5 mg/kg組和10 mg/kg組的ALT、AST、TG和空腹血糖水平呈現(xiàn)劑量依賴性降低，且POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組的ALT、AST、TG和空腹血糖水平降低更顯著(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組血清生化指標(biāo)和空腹血糖水平的比較

2.2 POTF對(duì)NAFLD小鼠肝損傷的影響大體上，對(duì)照組小鼠肝臟未見異常；NAFLD組肝臟體積增大，質(zhì)地變硬，局部有一定的變黃和質(zhì)地油膩；POTF組較NAFLD組的異常有不同程度的減輕。對(duì)照組小鼠肝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布；NAFLD組小鼠肝組織細(xì)胞中央靜脈不規(guī)則，細(xì)胞排列不均勻，結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壞死。與NAFLD組比較，POTF組小鼠肝組織細(xì)胞的壞死情況均得到減輕，且隨著POTF劑量的增加，減輕效果更加顯著，POTF 10 mg/kg組接近對(duì)照組。由此可見，POTF可以改善NAFLD小鼠的肝損傷。詳見圖1。

圖1 小鼠肝損傷的H-E染色(×200)

2.3 POTF對(duì)NAFLD小鼠脂質(zhì)堆積的影響油紅O染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，NAFLD組小鼠肝組織細(xì)胞中有大量的紅色脂滴聚集；與NAFLD組比較，POTF組的脂滴聚集逐漸減少，且隨著POTF劑量增加效果更明顯，POTF 10 mg/kg組接近對(duì)照組。由此可見，POTF可以減緩NAFLD小鼠的脂質(zhì)堆積。詳見圖2。

圖2 小鼠脂肪堆積的油紅O染色(×200)

2.4 POTF對(duì)NAFLD小鼠脂肪代謝的影響Western blotting檢測(cè)脂肪合成代謝相關(guān)指標(biāo)ACC和脂肪分解代謝相關(guān)指標(biāo)CPT-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組(CPT-1 0.140±0.020，ACC 0.010±0.006)比較，NAFLD組的CPT-1的表達(dá)量(0.010±0.005)顯著下調(diào)(P<0.05)，而ACC的表達(dá)量(0.720±0.050)顯著上調(diào)(P<0.05)。與NAFLD組比較，POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組CPT-1表達(dá)量(0.090±0.030，0.180±0.035)顯著上調(diào)(P<0.05)，而ACC表達(dá)量(0.080±0.045，0.020±0.010)顯著下調(diào)(P<0.05)。這提示，POTF可以促進(jìn)NAFLD小鼠的脂肪分解代謝，并抑制NAFLD小鼠的脂肪合成代謝。詳見圖3。

注：A. Western blotting檢測(cè)CPT-1和ACC蛋白的表達(dá)；B. 各組CPT-1和ACC表達(dá)量的比較。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NAFLD組比較，#P<0.05。圖3 Western blotting檢測(cè)ACC和CPT-1的蛋白表達(dá)水平

2.5 POTF對(duì)NAFLD小鼠SOD活性及MDA、GSH水平的影響與對(duì)照組比較，NAFLD組的SOD活性和GSH水平顯著降低(P<0.05)，而MDA水平顯著升高(P<0.05)。與NAFLD組比較，POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組SOD活性和GSH水平顯著升高(P<0.05)，而MDA水平顯著降低(P<0.05)。由此可見，POTF可以改善NAFLD小鼠的氧化應(yīng)激。詳見表2。

表2 各組SOD活性及MDA、GSH水平的比較

2.6 POTF對(duì)NAFLD小鼠肝組織中IL-6和IL-10水平的影響ELISA檢測(cè)肝組織中促炎因子IL-6和抗炎因子IL-10水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組[IL-6(16±9)pg/mL，IL-10(29±4)pg/mL]比較，NAFLD組IL-6水平[(114±15)pg/mL]顯著升高(P<0.05)，而IL-10水平[(4±2)pg/mL]顯著降低(P<0.05)。與NAFLD組比較， POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組IL-6水平[(64±15)pg/mL，(37±11)pg/mL]顯著降低(P<0.05)，而IL-10水平[(13±6)pg/mL，(27±5)pg/mL]顯著升高(P<0.05)。由此可見，POTF可以改善NAFLD小鼠的炎癥反應(yīng)。詳見圖4。

注：A. 各組IL-6水平的比較；B. 各組IL-10水平的比較。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NAFLD組比較，#P<0.05。圖4 ELISA測(cè)定IL-6和IL-10的水平

2.7 POTF對(duì)NAFLD小鼠肝組織中NF-κB p65表達(dá)的影響IHC檢測(cè)了與炎癥相關(guān)的NF-κB p65在肝組織中的表達(dá)情況。與對(duì)照組[(2±2)%]比較，NAFLD組NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量[(46±4)%]顯著增加(P<0.05)；與NAFLD組比較， POTF 5 mg/kg組和10 mg/kg組NF-κB p65 相對(duì)表達(dá)量[(23±6)%，(14±5)%]顯著降低(P<0.05)。由此進(jìn)一步證實(shí)，POTF可以通過抑制NF-κB p65的表達(dá)緩解炎癥反應(yīng)。詳見圖5。

注：A. 在顯微鏡下觀察小鼠肝組織中NF-κB p65相對(duì)表達(dá)(×200)；B. 各組NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量的比較。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NAFLD組比較，#P<0.05。圖5 IHC檢測(cè)小鼠肝組織中NF-κB p65的表達(dá)

3 討論

馬齒莧是藥食同源的中藥材，在不同體系中均表現(xiàn)出對(duì)肝損傷的治療作用[12]，其作用機(jī)制包括減輕炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡和改善脂質(zhì)代謝等[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，POTF可明顯改善NAFLD小鼠肝組織損傷和脂質(zhì)堆積情況，POTF組ALT、AST、TG、空腹血糖、ACC、IL-6、MDA及NF-κB p65水平相較于NAFLD組顯著降低，而CPT-1水平、GSH水平、SOD活性及IL-10水平顯著升高。這提示，POTF可能通過減輕脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)改善高脂飲食昆明小鼠的NAFLD。

NAFLD的主要病理特征之一是以肝細(xì)胞內(nèi)TG積蓄為主的代謝紊亂，且肝細(xì)胞受損。胰島素抵抗是NAFLD的重要危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)，如果存在肝細(xì)胞脂肪的大量積累與系統(tǒng)性肝胰島素抵抗，就會(huì)致使肝臟抗脂質(zhì)毒性保護(hù)和脂肪組織產(chǎn)生自由基之間的不平衡，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞凋亡等[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝受損后，生化指標(biāo)ALT、AST、TG水平出現(xiàn)異常[17]。馬齒莧可提高四氧嘧啶糖尿病小鼠血清胰島素水平，降低小鼠空腹血糖，并具有較強(qiáng)的調(diào)脂作用[4]。也有薈萃分析顯示，馬齒莧可能具有改善血脂和血糖水平的作用[18]。上述研究與本研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD小鼠的ALT、AST、TG和空腹血糖都異常升高，H-E和油紅O染色也證實(shí)NAFLD小鼠發(fā)生了肝組織損傷且脂質(zhì)堆積嚴(yán)重。而經(jīng)過一定劑量的POTF給藥后，上述癥狀得到明顯緩解，顯然POTF在NAFLD小鼠中具有降血脂和血糖的功效。本研究脂肪代謝標(biāo)志物CPT-1和ACC的蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步說明，POTF可通過上調(diào)脂肪分解代謝指標(biāo)CPT-1同時(shí)下調(diào)脂肪合成代謝指標(biāo)ACC對(duì)脂質(zhì)代謝起調(diào)控作用。

固有免疫激活相關(guān)的炎癥反應(yīng)在NAFLD的誘發(fā)和加重中起重要作用[19]。來自脂肪組織的炎癥信號(hào)、腸道微生物的產(chǎn)物和肝炎導(dǎo)致的受傷或垂死載脂肝細(xì)胞信號(hào)均能激活肝臟內(nèi)免疫細(xì)胞的固有免疫，誘發(fā)和加重肝炎，導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)固有免疫和炎癥的調(diào)控機(jī)制可能是二甲雙胍等對(duì)NAFLD的作用[20]。抑制炎癥可能是阻止NAFLD惡性進(jìn)展的有效手段，而馬齒莧具有典型的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食的小鼠中，POTF能降低IL-6水平，增加IL-10水平，表明其抑制NAFLD可能與炎癥抑制有關(guān)。

炎癥和脂肪變性可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和壞死等一系列惡性變化，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化進(jìn)展[22]。這些因素往往在免疫系統(tǒng)作用下相互促進(jìn)[23]。NAFLD自身造成的代謝綜合征以及在患者基因突變等綜合因素影響下，肝病可進(jìn)一步進(jìn)展甚至導(dǎo)致肝癌[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺損傷有抗炎、抗氧化作用[6]。還有研究證實(shí)，POTF可通過下調(diào)大鼠肝纖維化細(xì)胞TGF-β1基因及蛋白表達(dá)有效治療肝細(xì)胞纖維化病變，預(yù)防肝癌及肝硬化[25]。在大鼠急性酒精性脂肪肝病模型中，POTF能有效改善炎癥、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝，進(jìn)而減輕大鼠的急性酒精性脂肪肝病[13]。本研究對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)分子SOD、MDA和GSH的檢測(cè)結(jié)果顯示，POTF可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激造成的SOD和GSH水平下降，并消除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的積累。POTF也可減少NAFLD小鼠的促炎因子IL-6水平，并刺激抗炎因子IL-10高表達(dá)。這些結(jié)果均提示，POTF可明顯改善NAFLD小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。用IHC進(jìn)一步檢測(cè)與炎性因子合成相關(guān)的NF-κB p65在組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示POTF可減輕氧化應(yīng)激，下調(diào)NAFLD小鼠NF-κB p65的高表達(dá)，進(jìn)而抑制肝臟損傷。

綜上所述，POTF可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝異常、緩解氧化應(yīng)激和抑制炎癥反應(yīng)來改善NAFLD小鼠的肝損傷。本研究為POTF作為治療NAFLD的潛在、有效的藥物提供了基礎(chǔ)證據(jù)。