依托考昔抑制SDF-1/CXCR4信號通路影響骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖、凋亡及炎性因子表達

王雷，余德濤，邢禎全

(三亞市人民醫(yī)院 脊柱關節(jié)外科，三亞 572000)

骨關節(jié)炎是臨床常見的一種關節(jié)軟骨退行性病變，主要癥狀為關節(jié)畸形、關節(jié)疼痛等，常發(fā)生于老年人群。研究發(fā)現，炎性因子分泌量增加可影響滑膜細胞及軟骨細胞釋放其他介質而導致軟骨細胞凋亡，軟骨細胞增殖、凋亡異?？纱龠M骨關節(jié)炎的發(fā)生[1-4]。依托考昔具有消炎鎮(zhèn)痛的功效，可治療骨關節(jié)炎[5]。但關于依托考昔治療骨關節(jié)炎的作用機制尚未完全闡明。基質細胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)信號通路在骨關節(jié)炎發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調控作用，阻斷SDF-1/CXCR4信號通路或許能作為治療骨關節(jié)炎的新方向[6]。但依托考昔是否可通過調控SDF-1/CXCR4信號通路而影響骨關節(jié)炎的發(fā)生尚未闡明。因此，本研究主要探討依托考昔對骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡和炎性因子表達的影響及其對SDF-1/CXCR4信號通路的調控作用，以期為研究依托考昔治療骨關節(jié)炎的作用機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 研究對象 選取2018年1—12月于三亞市人民醫(yī)院進行全膝關節(jié)置換手術的骨關節(jié)炎患者12例為研究對象，其中男性8例、女性4例，年齡(56.35±6.35)歲，取出患者關節(jié)軟骨片置于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液內保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準，研究對象均知情同意。

1.1.2 試劑 依托考昔購自湖北鴻鑫瑞宇精細化工有限公司；DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；FBS購自杭州仟諾生物科技有限公司；胰蛋白酶購自廣州達暉生物技術股份有限公司；Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司；MTT購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自北京群曉科苑生物技術有限公司；TNF-α、IL-1β檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉錄與熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人未剪切的Caspase-3(pro-Caspase-3)、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔二抗購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨關節(jié)炎軟骨細胞的原代培養(yǎng) 采用PBS洗滌骨關節(jié)軟骨組織，剪碎(體積1 cm3)，加入0.25%胰蛋白酶室溫消化30 min，棄胰蛋白酶消化液，加入0.2%Ⅱ型膠原酶室溫消化18 h，每隔8 h收集1次細胞，使用200目濾網過濾，將細胞轉移至離心管內，在4 ℃條件下以111.9×g離心10 min，棄上清液，加入含有20%FBS的培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，換液(每天3 次)，待細胞生長密度達到80%時使用0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液制備細胞懸液，細胞傳代，收集第3代細胞進行后續(xù)試驗[7]。

1.2.2 藥物處理及試驗 分組取處于對數生長期的骨關節(jié)炎軟骨細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后加入DMEM培養(yǎng)液制備細胞懸液，調整細胞密度為2.5×104個/mL，并將其接種于96孔板(100 μL/孔)，分別加入濃度為12.5、25.0和50.0 ng/mL的依托考昔處理24 h[8]，分別記作依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為對照組。

1.2.3 細胞增殖的MTT檢測 取處于對數生長期的骨關節(jié)炎軟骨細胞，按照“1.2.2”分組處理，加入MTT溶液20 μL培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μL，室溫避光孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔的光密度[D(490 nm)]值，計算細胞存活率。細胞存活率=(各試驗組D值-空白對照組D值)/(正常對照組D值-空白對照組D值)×100%。

1.2.4 細胞凋亡率的FACS檢測 收集各組處于對數生長期的骨關節(jié)炎軟骨細胞，用預冷PBS洗滌，在4 ℃條件下以111.9×g離心5 min，棄上清液，向細胞沉淀中加入500 μL結合緩沖液懸浮細胞，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，充分混勻，室溫避光孵育20 min，檢測細胞凋亡率。

1.2.5 TNF-α、IL-1β水平的ELISA檢測 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測TNF-α、IL-1β的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6SDF-1、CXCR4 mRNA表達水平的qRT-PCR檢測 收集各組處于對數生長期的骨關節(jié)炎軟骨細胞，采用TRIzol法提取細胞中的總RNA。應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成(表1)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算SDF-1、CXCR4 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.2.7 pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白表達的Western blotting檢測 收集各組處于對數生長期的骨關節(jié)炎軟骨細胞，加入適量RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細胞總蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，封閉，加入pro-Caspase-3(1∶800)、cleaved Caspase-3(1∶800)與內參GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)，在4 ℃條件下孵育24 h，用TBST洗滌，分別加入二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加增強型化學發(fā)光試劑顯影，應用ImageJ v 1.8.0軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結果

2.1 依托考昔對骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖及凋亡的影響與對照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組間細胞存活率及細胞凋亡率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、圖2和表2。

圖1 依托考昔對骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡率的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與依托考昔低劑量組比較，#P<0.05；與依托考昔中劑量組比較，△P<0.05。圖2 各組骨關節(jié)炎軟骨細胞活性的比較

表2 各組骨關節(jié)炎軟骨細胞存活率及凋亡率的比較

2.2 依托考昔對骨關節(jié)炎軟骨細胞中Caspase-3的影響與對照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組pro-Caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，cleaved Caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3、表3。

圖3 各組骨關節(jié)炎軟骨細胞中Caspase-3蛋白的表達

表3 各組骨關節(jié)炎軟骨細胞中Caspase-3蛋白表達的比較

2.3 依托考昔對骨關節(jié)炎軟骨細胞中炎性因子表達的影響與對照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組TNF-α、IL-1β的水平顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組TNF-α、IL-1β的水平比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與依托考昔低劑量組比較，#P<0.05；與依托考昔中劑量組比較，△P<0.05。圖4 各組骨關節(jié)炎軟骨細胞中炎性因子表達水平的比較

2.4 依托考昔對骨關節(jié)炎軟骨細胞SDF-1/CXCR4的影響與對照組比較，依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組SDF-1、CXCR4 mRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)，且依托考昔低劑量組、依托考昔中劑量組、依托考昔高劑量組SDF-1、CXCR4 mRNA的表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05，表4)。

表4 各組骨關節(jié)炎軟骨細胞中SDF-1、CXCR4 mRNA表達的比較

3 討論

近年來，骨關節(jié)炎發(fā)病率逐年上升，已嚴重影響患者的生活質量。既往研究顯示，天然藥物、非甾體類抗炎藥等可用于骨關節(jié)炎的治療，但部分抗炎藥會對人體消化系統、神經系統等造成一定損害[9-10]。目前，關于依托考昔治療骨關節(jié)炎的作用機制尚未闡明，因而本研究主要探討依托考昔在骨關節(jié)炎治療過程中的作用機制。

依托考昔是一種臨床常用的高效抗炎藥物，具有抗炎、抗氧化等作用。研究發(fā)現，依托考昔治療關節(jié)炎具有副作用少、療效好等優(yōu)點[11-13]，但其作用機制尚未完全闡明。本研究分離培養(yǎng)人骨關節(jié)炎軟骨細胞，使用不同濃度的依托考昔處理后，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，且呈現劑量依賴性。這提示，依托考昔可抑制骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖。研究發(fā)現，Caspase是細胞凋亡的主要通路，Caspase-3是細胞凋亡反應中重要的調節(jié)因子，線粒體損傷后可促進細胞色素C釋放至細胞質而激活Caspase-3級聯反應，從而促進細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，用依托考昔處理后pro-Caspase-3蛋白水平顯著升高，cleaved Caspase-3蛋白水平顯著降低，且呈現劑量依賴性。這提示，依托考昔可能通過調控線粒體途徑抑制骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡。軟骨細胞損傷后巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1β等炎性因子，參與軟骨退變過程，TNF-α、IL-1β相互作用可加重滑膜炎癥及關節(jié)軟骨的退變程度，還可抑制軟骨細胞增殖[15]。本研究結果顯示，用依托考昔處理后TNF-α、IL-1β的水平顯著降低，并呈現劑量依賴性。這提示，依托考昔可減輕骨關節(jié)炎軟骨細胞的炎癥損傷。

SDF-1/CXCR4信號通路屬于炎癥反應偶聯分子對，SDF-1可與其受體CXCR4相互作用參與骨關節(jié)炎等炎癥反應的發(fā)生及發(fā)展過程，抑制SDF-1/CXCR4信號通路的活化可降低炎癥反應[9，16-17]。本研究結果顯示，依托考昔可抑制SDF-1、CXCR4的表達，且隨著藥物使用劑量的增加其抑制作用顯著增強。這提示，依托考昔可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路減輕骨關節(jié)炎軟骨細胞的損傷。

綜上所述，依托考昔可能通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路促進骨關節(jié)炎軟骨細胞增殖、抑制細胞凋亡及減少炎癥反應，但關于其具體作用機制仍需進一步探討。