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    淺析馬鈴薯脫毒試管苗污染防控對策

    2021-12-06 15:42:51次旦卓瑪
    農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:雜菌種薯試管

    次旦卓瑪

    (西藏日喀則市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,西藏 日喀則 857000)

    馬鈴薯是很多人喜愛的一種食物,不僅營養(yǎng)價值豐富,而且有抗衰老、減肥、防脫發(fā)等諸多功效。越來越多的人都喜歡這一健康食物,因此,馬鈴薯的市場發(fā)展前景巨大,我國也將其列為中國第5大糧食作物。西藏農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)中馬鈴薯成為重點發(fā)展產(chǎn)業(yè),成為幫助當(dāng)?shù)孛癖娒撠氈赂坏闹饕a(chǎn)業(yè)。近年來西藏地區(qū)主要將脫毒種薯繁育與質(zhì)控管理作為工作重點,但在馬鈴薯脫毒試管苗規(guī)?;旆毖芯恐薪?jīng)常出現(xiàn)脫毒試管苗受污染問題,極大影響到馬鈴薯原種生產(chǎn)成本與生產(chǎn)品質(zhì)。為此,如何防范馬鈴薯脫毒試管苗污染,提高快繁效率,成為當(dāng)前馬鈴薯生產(chǎn)亟待解決的一個重要問題。

    1 關(guān)于脫毒馬鈴薯的概述

    所謂脫毒種薯就是利用一系列技術(shù)將馬鈴薯種薯內(nèi)的病毒清除掉,得到健康無病毒或極少帶病毒的種薯[1]。脫毒種薯不僅品質(zhì)優(yōu)良、早熟,而且高產(chǎn)。種薯與馬鈴薯的產(chǎn)量與品質(zhì)有著緊密的聯(lián)系。如果種薯質(zhì)量差,則馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)將明顯下降,馬鈴薯植株與塊莖遭到病毒侵入,將導(dǎo)致其迅速退化,表現(xiàn)出多種病癥,從而造成馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)。為此,要借助相關(guān)物理、化學(xué)、生物方面的技術(shù)盡量清除薯塊中所存在的病毒,獲得安全、無毒的種薯。目前,研究發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致馬鈴薯退化的病毒有30多種,對馬鈴薯危害最嚴(yán)重的有6種,包括馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯S病毒(PVS)及馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)。根據(jù)馬鈴薯種植實踐經(jīng)驗發(fā)現(xiàn),葉片卷曲皺縮、顏色不均,莖稈矮小細(xì)弱,塊莖變形龜裂,產(chǎn)量呈下降趨勢,說明馬鈴薯已出現(xiàn)“退化”。病毒感染是造成種薯“退化”的重要原因,病毒會逐漸在薯塊內(nèi)部積累,造成產(chǎn)量下降,馬鈴薯品質(zhì)變差[2]。在病毒的不斷侵染與累積影響下,作為下一代“種子”的薯塊無法自行清除體內(nèi)的病毒,從而使病毒侵染逐年加重。這將阻礙馬鈴薯植株充分發(fā)揮自身品種的優(yōu)勢,導(dǎo)致大幅減產(chǎn)。通過借助生物技術(shù)清除種薯內(nèi)部病毒,使其相關(guān)生理功能與生產(chǎn)特性得到恢復(fù),才能防范馬鈴薯發(fā)生退化,從而確保馬鈴薯獲得最佳的商品性狀與產(chǎn)量。這正是種薯脫毒的原因,也是脫毒馬鈴薯能夠促進(jìn)增產(chǎn)增收的主要原因。

    2 脫毒馬鈴薯試管苗快繁過程中的污染病變及表現(xiàn)

    馬鈴薯脫毒試管苗快繁研究中主要會采用組織培養(yǎng)技術(shù),而難免會存在試管苗污染問題。其中,污染病原大多數(shù)是細(xì)菌與真菌2類。細(xì)菌污染一般在接種24~48h就會出現(xiàn),通??梢娕囵B(yǎng)基或材料表面存在黃色或乳白色黏液狀物體,菌落有渾濁的水跡狀,有時可見菌落呈泡沫發(fā)酵狀。真菌污染則表現(xiàn)癥狀出現(xiàn)較為遲緩,通常在接種5~10d才可見癥狀。當(dāng)剛發(fā)生污染時可見到霧斑,呈針狀,之后會形成菌絲,短時間內(nèi)長出孢子,顏色為黑、白、綠、黃。

    3 脫毒馬鈴薯試管苗污染的常見原因

    3.1 苗源與苗源瓶受到污染

    苗源瓶內(nèi)的苗源受到雜菌的侵染,因為是感染初期,菌源過小,一般難以被肉眼發(fā)現(xiàn)。將其接種到培養(yǎng)基瓶內(nèi)將會導(dǎo)致更多苗源瓶感染。苗源瓶常常攜帶有一些雜菌、細(xì)菌、真菌、霉菌,原因在于表面消毒不充分徹底。在接種操作時容易被帶入接種瓶,導(dǎo)致感染。

    3.2 培養(yǎng)基帶菌

    培養(yǎng)基需通過濕熱滅菌法處理,但偶爾有部分耐高溫雜菌不會被殺死,或者在高壓滅菌處理培養(yǎng)基時滅菌不徹底導(dǎo)致部分雜菌殘留。通過高壓消毒的培養(yǎng)基未緩放3~4d,在高壓消毒后就開始接種,因此,帶菌的培養(yǎng)基直接被用于接種,從而導(dǎo)致人為感染[3]。

    3.3 操作傳染與氣流帶菌

    工作人員在開展接種工作時自身攜帶細(xì)菌或者使用器械消毒處理不徹底帶菌。如,工作人員在對雙手消毒時不徹底、不仔細(xì),對剪刀、鑷子等器械消毒不到位,容易將細(xì)菌帶到培養(yǎng)基上。氣流傳菌主要是接種室與組培室內(nèi)空氣中存在一些雜菌。當(dāng)工作人員在接種操作的過程中大聲講話,拿放物體不輕緩,從而容易造成脫毒苗與培養(yǎng)基再次受到污染。

    4 防范對策

    4.1 接種前徹底清除污染菌源

    4.1.1 清除容器雜菌

    要確保容器清潔,在清洗前需將污染的與未污染的容器分開再進(jìn)行清洗。清洗后的玻璃容器要發(fā)亮,瓶壁沒有掛水珠,內(nèi)外壁水膜均勻。工作人員在拿取容器時注意盡量不要碰到內(nèi)壁。瓶蓋也需仔細(xì)刷洗,待晾干后與瓶子存放在一邊備用。

    4.1.2 清除水質(zhì)雜菌

    選用蒸餾水配制培養(yǎng)基母液,并且將母液放在4℃的冰箱內(nèi)保存。盡量用蒸餾水或純凈、無色透明、無懸浮物的食用水制作培養(yǎng)基,最大限度避免菌源與雜菌感染。灌裝培養(yǎng)基操作要干凈利索,確保瓶口與瓶壁未與培養(yǎng)基發(fā)生黏結(jié),迅速封口,并及時滅菌。嚴(yán)格執(zhí)行濕熱滅菌操作,等鍋內(nèi)壓力增至0.5kg·cm-2時將排氣閥打開,待冷空氣全部排完后,將排氣閥關(guān)閉確保壓力保持在1.1kg·cm-2左右,溫度調(diào)節(jié)為120~121℃,滅菌時間保持20~25min,最多為30min,從而防止造成培養(yǎng)基成分改變[4]。

    4.1.3 選用無污染培養(yǎng)基

    培養(yǎng)基經(jīng)過徹底滅菌處理后需轉(zhuǎn)移至無菌室,在常溫條件下放置3~4d,篩選出有雜菌污染的培養(yǎng)基,將其剔除,最后留下干凈無菌的培養(yǎng)基用于接種。

    4.1.4 接種室要保證干凈清潔

    在每次開始接種前先用紫外線燈對工作臺與接種室內(nèi)環(huán)境進(jìn)行照射消毒,時間以20~30min為宜,用75%酒精進(jìn)行噴霧處理。通常隔5~7d對接種室進(jìn)行徹底消毒1次,按照1∶3的比例配制高錳酸鉀與甲醛溶液,在室內(nèi)熏蒸10~12h,以徹底消滅空氣中的各種菌源。要求工作人員的工作服、帽子、口罩都必須保證干凈,定期予以消毒。對消毒鍋要經(jīng)常進(jìn)行檢查,評估滅菌效果,一旦發(fā)現(xiàn)問題應(yīng)馬上進(jìn)行檢修。

    4.2 嚴(yán)格遵循無菌要求開展接種操作

    對待轉(zhuǎn)基礎(chǔ)苗要反復(fù)觀察,確認(rèn)沒有污染才可以取用。利用酒精棉充分擦拭待轉(zhuǎn)苗瓶的外側(cè)與瓶蓋,以清除附著在上面的雜菌,再將其放置于無菌室。工作人員需洗手更換衣服戴好口罩方可進(jìn)入無菌室,進(jìn)入室內(nèi)后使用75%酒精再次對手進(jìn)行消毒,才能開展下一步工作[5]。

    選用75%酒精作為消毒劑,清潔工作臺面與臺壁。注意超凈工作臺上面不可堆放太多的物品,苗源瓶(基礎(chǔ)苗)、接種瓶均不宜放置太多,容易引起氣流不通暢,從而導(dǎo)致操作區(qū)的空氣凈化不完全,造成不可避免的污染。對接種器械要進(jìn)行徹底滅菌處理,將鑷子、支架、剪刀等工具放在酒精燈外焰上來回消毒,由正到反,從外到內(nèi)均要消毒,然后放在一旁晾涼。開始接種時工作人員要把瓶口接近酒精燈火焰,完成一瓶接種后,需重新對全部工具進(jìn)行徹底消毒方可進(jìn)行下一瓶接種。工作人員在接種操作時要做到動作迅速、規(guī)范、熟練,禁止與他人講話,避免造成污染。接種完畢后必須將培養(yǎng)基瓶口進(jìn)行嚴(yán)密的封閉處理,從而盡量阻止瓶內(nèi)與室內(nèi)空氣間形成對流,從而防范氣流傳菌。

    4.3 嚴(yán)密防范內(nèi)生細(xì)菌

    Wilson對內(nèi)生菌的定義為:在整個或部分生活周期中侵染活的植物體,但不會導(dǎo)致植物組織出現(xiàn)明顯癥狀的微生物,主要包括細(xì)菌與真菌。材料內(nèi)部所帶細(xì)菌大多潛伏較深,常規(guī)的表面消毒防范難以將其徹底清除,伴隨材料一同參與到培養(yǎng)過程中,進(jìn)而導(dǎo)致組培污染[6]。

    有的時候在外植體的初級培養(yǎng)過程中難以察覺內(nèi)生細(xì)菌,通過逐步繁殖,菌量會逐漸增多,最終在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來。就污染狀態(tài)分析可知,內(nèi)生菌污染多見于植物材料的四周,通常從培養(yǎng)基內(nèi)往外部伸展,其發(fā)生時間一般在4d以上,菌的種類也比較單一,而接觸性細(xì)菌通常在2~4d就會有所癥狀。

    對此,可將相關(guān)抑菌劑或抗生素加入到培養(yǎng)基中,低溫預(yù)處理、減小pH值等措施,用于防范細(xì)菌等內(nèi)生菌的污染。在運用抗生素抑菌時應(yīng)注意以下幾點:對癥下藥,不可隨意使用抑菌劑;選擇最合適的抑制濃度;了解抗生素在培養(yǎng)基上面能否起效,穩(wěn)定性是否良好;確??股貙χ参锊粫a(chǎn)生不良影響。此外,應(yīng)按合理的流程開展擴大繁殖工作。獲得脫毒試管苗后需要選取一部分留作“原種”進(jìn)行儲存,通過分批繁殖與復(fù)檢確定無問題后才能擴大栽植規(guī)模。

    4.4 加強接種后的管理

    4.4.1 人員管理

    杜絕非工作人員進(jìn)入,工作人員在進(jìn)入前需做好清潔措施,穿戴專門的工作服,套上鞋套,避免將外部雜菌帶入。

    4.4.2 定期消毒

    2~3d對地面消毒1次,消毒劑選用百菌清或甲醛溶液,每周用甲醛熏蒸1次,操作流程為:取50mL甲醛溶液與15g高錳酸鉀,將二者混合,并將接種室門窗密閉24h,散發(fā)出來的甲醛蒸汽可以清除空氣中的相關(guān)細(xì)菌與真菌。同時,用75%酒精進(jìn)行噴霧處理。

    4.4.3 剔除受污染的瓶苗

    要及時將培養(yǎng)室內(nèi)發(fā)生污染的瓶苗剔除,通過高壓鍋對污染苗進(jìn)行滅菌處理再進(jìn)行遠(yuǎn)距離統(tǒng)一銷毀,徹底清除病毒源。對于非常珍貴、稀少的瓶苗發(fā)生污染時,若污染程度輕微應(yīng)采取相應(yīng)的挽救措施。先把瓶苗從培養(yǎng)室中移出,并用酒精棉遮擋污染部位,剪掉植株頂部,然后將75%酒精作為沖洗劑,沖洗30s左右,并用無菌水沖洗2遍。對容器表面徹底消毒后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,并用0.1%的Hg2CL2溶液浸泡約5~10min,用無菌水沖洗5遍,轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基上。經(jīng)凈化處理的材料需要單獨保存,與其它脫毒苗分開,觀察數(shù)日判斷沒有污染方可轉(zhuǎn)移到原處保存。為強化滅菌效果,一般可選擇混合消毒液進(jìn)行消毒,或多次消毒的辦法。若消毒效果不好,可加入適量的抗生素在培養(yǎng)基中。

    綜上所述,要根據(jù)試管苗被污染的常見原因采取有效的應(yīng)對措施,盡快構(gòu)建起一套完善的預(yù)防馬鈴薯脫毒試管苗工廠化生產(chǎn)污染問題的相關(guān)機制,為實現(xiàn)馬鈴薯的豐產(chǎn)豐收打好基礎(chǔ)。

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