數(shù)量遺傳性狀基因定位方法研究進(jìn)展

田玉，馬春紅，宋麗華，溫之雨，董文琦，趙璞*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050031；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北石家莊 050051；3.饒陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 饒陽(yáng) 053900）

植物的大部分農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀屬于數(shù)量遺傳性狀[1，2]。數(shù)量遺傳性狀由多基因調(diào)控，在分離群體中表現(xiàn)為連續(xù)分布，且易受到環(huán)境影響。數(shù)量遺傳性狀的深度解析與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)，分子標(biāo)記、作圖群體以及統(tǒng)計(jì)分析方法的應(yīng)用和發(fā)展顯著提高了數(shù)量遺傳性狀基因定位效率。

1 分子標(biāo)記

分子標(biāo)記反映不同個(gè)體間DNA序列的變異，可以較為直觀(guān)地反映DNA水平的遺傳多態(tài)性，具有共顯性的特點(diǎn)[3]。與利用表型進(jìn)行目標(biāo)性狀篩選相比，分子標(biāo)記具有不影響目標(biāo)性狀表達(dá)、不受環(huán)境影響、數(shù)量極多、能夠?qū)﹄[性遺傳性狀準(zhǔn)確篩選、與基因變異直接相關(guān)、不與其他性狀連鎖等優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速，因此作為作物遺傳改良的重要工具廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因挖掘、基因定位、基因庫(kù)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建等方面。根據(jù)其基礎(chǔ)技術(shù)發(fā)展的過(guò)程，分子標(biāo)記可分為3代：

第1代：以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的RFLP標(biāo)記。DNA序列改變時(shí)酶切位點(diǎn)會(huì)同時(shí)發(fā)生變化，從而產(chǎn)生RFLP標(biāo)記擴(kuò)增條帶的多態(tài)性。RFLP標(biāo)記因其要求DNA模板量大、分析過(guò)程繁瑣、價(jià)格高昂、靈敏度不高等問(wèn)題，目前逐漸被新興分子標(biāo)記所取代[4]。

第2代：以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記。第2代分子標(biāo)記主要有RAPD標(biāo)記、ISSR標(biāo)記、SSR標(biāo)記、STS標(biāo)記、AFLP標(biāo)記、SCAR標(biāo)記、SRAP標(biāo)記和CAPS標(biāo)記等。其中，SSR標(biāo)記在整個(gè)基因組中分布較為均勻，具有較高的重復(fù)率和可靠性，是熱門(mén)遺傳標(biāo)記[5]，廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析，以及種子純度和品種鑒定等方面。利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景分析時(shí)需要大量覆蓋目標(biāo)區(qū)段的引物，而引物的設(shè)計(jì)需建立在明確簡(jiǎn)單重復(fù)序列兩端核酸信息的基礎(chǔ)上，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到了一定限制[6，7]。AFLP標(biāo)記利用特異性引物對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)鑒定DNA多態(tài)性[8]，具有穩(wěn)定可靠、易重復(fù)、操作簡(jiǎn)單便捷、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種、遺傳多樣性分析以及種質(zhì)資源鑒定等方面[9]，但由于受專(zhuān)利保護(hù)，目前僅在非盈利性的研究中應(yīng)用。

第3代：基于全基因組測(cè)序技術(shù)的分子標(biāo)記。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，作為第3代分子標(biāo)記代表的SNP標(biāo)記被越來(lái)越多地應(yīng)用于QTL定位。其多態(tài)性表現(xiàn)為單堿基變異，即不同等位基因間同一位點(diǎn)的單個(gè)堿基插入、缺失或者替換[10]。與前2代分子標(biāo)記相比，第3代分子標(biāo)記具有一定的優(yōu)越性：（1）數(shù)量更多，密度更大，在全基因組分布更加均勻；（2）突變率低，穩(wěn)定性高；（3）大部分情況下表現(xiàn)為二等位多態(tài)性，組成的堿基類(lèi)型少；（4）SNP本身就可能是候選基因位點(diǎn)，當(dāng)SNP發(fā)生在基因內(nèi)部時(shí)就有可能影響基因表達(dá)或?qū)е碌鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。SNP標(biāo)記主要依托基因組測(cè)序或者基因芯片，檢測(cè)成本和技術(shù)要求較高，目前廣泛應(yīng)用于群體結(jié)構(gòu)和群體親緣關(guān)系、種質(zhì)資源遺傳演化等方面[11，12]。根據(jù)不同應(yīng)用技術(shù)，SNP標(biāo)記具有不同的開(kāi)發(fā)方式。

混合群體分離分析法（BSA）是利用具有2個(gè)極端性狀的個(gè)體分別組成混池測(cè)序來(lái)開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記的一種方法。其主要原理是通過(guò)對(duì)比群體中極端性狀或代表性性狀個(gè)體組成的混池的DNA序列，篩選顯著的差異位點(diǎn)。隨著技術(shù)革新使得測(cè)序成本降低，目前BSA技術(shù)已成為QTL定位、候選基因挖掘等研究的有力工具[13～15]。

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)也是SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)的一類(lèi)方法，其中SLAF-Seq技術(shù)、RAD-seq技術(shù)和GBS-seq應(yīng)用較為廣泛。該方法首先通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶分割基因組，選擇性地回收一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的酶切片段進(jìn)行測(cè)序，從而將基因組的復(fù)雜程度大幅簡(jiǎn)化，操作相對(duì)更簡(jiǎn)便，對(duì)特定區(qū)域鑒定到SNP位點(diǎn)密度更高，試驗(yàn)周期短，不要求必須是具有參考基因組的物種，適用于大樣本量研究，從而有效地實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化基因分析以及重要性狀候選基因的預(yù)測(cè)[16～22]。

全基因組重測(cè)序技術(shù)是對(duì)已知基因組序列物種中的個(gè)體再次進(jìn)行基因測(cè)序并分析比較個(gè)體間的遺傳差異性，是開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記的另一類(lèi)方法。與簡(jiǎn)化基因組技術(shù)測(cè)序采用酶切技術(shù)不同，重測(cè)序技術(shù)利用超聲波將DNA隨機(jī)打斷，獲得不受酶切位點(diǎn)的限制DNA片段，從而大大提高獲取SNP的數(shù)量以及密度[23，24]。

SNP標(biāo)記還可以通過(guò)芯片方式進(jìn)行DNA多態(tài)性檢測(cè)。該種芯片的開(kāi)發(fā)需要全基因組信息，根據(jù)參考基因組序列設(shè)計(jì)包含特定SNP位點(diǎn)的熒光信號(hào)探針。參試樣本DNA與芯片上被標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，根據(jù)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)弱即可判斷樣本DNA與核酸探針互補(bǔ)序列的區(qū)段是否存在SNP突變?；谌蚪M開(kāi)發(fā)的SNP芯片，通常包含數(shù)以萬(wàn)計(jì)的SNP位點(diǎn)，具有高效、便捷的特點(diǎn)[25～30]。

2 作圖群體

大部分QTL定位方法均需要構(gòu)建遺傳群體，遺傳群體是構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位的基石。根據(jù)遺傳背景的差異大小，遺傳群體被分為初級(jí)群體和高級(jí)群體2種。

初級(jí)作圖群體個(gè)體間遺傳背景差異較大，根據(jù)遺傳穩(wěn)定性又可分為臨時(shí)性分離群體和永久性分離群體，主要包括F2、F3、BC1、單倍體群體（DH）、重組自交系群體（RIL）等。其中，F(xiàn)2群體及其衍生家系、回交群體屬于臨時(shí)性分離群體，具有易配制、群體基因型豐富、作圖分析效率高的特點(diǎn)，但重復(fù)率低，不能進(jìn)行有效連續(xù)性研究；DH、RIL和永久F2群體（IF2）屬于永久性群體，具有后代穩(wěn)定、可開(kāi)展多年多點(diǎn)試驗(yàn)的特點(diǎn)，但也存在一定缺點(diǎn)，如DH群體構(gòu)建時(shí)易受誘導(dǎo)加倍影響造成群體遺傳背景偏分離而影響作圖的準(zhǔn)確性，RIL群體只能計(jì)算加性效應(yīng)但不能夠計(jì)算顯性效應(yīng)，IF2群體變異豐富但不適于精細(xì)定位。

高級(jí)作圖群體的群體基因組背景高度一致且與輪回親本相同，個(gè)體僅含少量供體親本片段，主要包括近等基因系類(lèi)群體（NILs）、單片段代換系（SSSL）群體和染色體片段置換系（CSSL）群體。高級(jí)作圖群體具有精度高、群體遺傳背景穩(wěn)定、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于QTL精細(xì)定位和圖位克隆，但存在群體構(gòu)建周期長(zhǎng)、工作量大的缺點(diǎn)。

3 數(shù)量遺傳性狀基因定位分析方法

3.1 連鎖分析

連鎖分析基于遺傳的連鎖原理。QTL連鎖分析常用的統(tǒng)計(jì)分析方法有區(qū)間作圖法（IM）、復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）、混合線(xiàn)性模型（MLM）、完備區(qū)間作圖法（ICIM）等。IM以回歸模型為基礎(chǔ)，通過(guò)遺傳群體開(kāi)發(fā)多態(tài)性標(biāo)記并構(gòu)建連鎖圖譜，每2個(gè)相鄰標(biāo)記間存在QTL的可能性（LOD值）依據(jù)極大似然函數(shù)進(jìn)行分析并對(duì)其進(jìn)行假設(shè)檢測(cè)，當(dāng)LOD值高于給定閾值時(shí)即認(rèn)為檢測(cè)到了相關(guān)QTL；其缺點(diǎn)是同一條染色體上存在多個(gè)調(diào)控性狀QTL的情況時(shí)，精度會(huì)下降。CIM是在IM中引入多元線(xiàn)性回歸分析，可以大幅度提高作圖的精度。MLM是基于混合線(xiàn)性模型的CIM，其通過(guò)多環(huán)境下的QTL定位聯(lián)合分析，使作圖精度和效率都得到有效提高。ICIM是王建康課題組在前人研究的基礎(chǔ)上提出的，可以對(duì)各種效應(yīng)成分進(jìn)行有效預(yù)測(cè)，還能接近無(wú)偏估計(jì)，更重要的是提高了QTL的精度和效率。

3.2 關(guān)聯(lián)分析

連鎖分析可以解析兩親本間的遺傳變異，但在挖掘種質(zhì)資源中等位變異時(shí)效率低、成本高，且由于連鎖分析依賴(lài)作圖群體，在群體數(shù)量和研究目標(biāo)性狀方面仍存在一定的缺陷。關(guān)聯(lián)分析法很好地解決了這些問(wèn)題。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是一種通過(guò)檢驗(yàn)全基因組遺傳標(biāo)記與表型變異關(guān)聯(lián)的顯著性來(lái)定位與性狀相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，在群體水平上解析性狀遺傳基礎(chǔ)的方法[31]。關(guān)聯(lián)分析具有許多優(yōu)點(diǎn)，如，可以直接使用自然群體或種質(zhì)資源，不需要專(zhuān)門(mén)構(gòu)建作圖群體；檢測(cè)效率高，可同時(shí)檢測(cè)同一座位的多個(gè)等位基因；節(jié)省研究時(shí)間；分辨率高。但相應(yīng)地，GWAS也存在一定的缺點(diǎn)，如，當(dāng)群體結(jié)構(gòu)分化明顯時(shí)容易造成假陽(yáng)性；需要的樣本量較大，足夠多的樣本才能保證p值足夠低，從而避免假陽(yáng)性和假陰性。同時(shí)，精確的表型鑒定是GWAS成功定位的重要保障。

近年來(lái)，QTL定位發(fā)展出了新的策略，如Ho-LAMap（ho index unified linkage and association mapping）、Pool-Seq、QTG-Seq等。Ho-LAMap是一種GWAS與連鎖分析相結(jié)合的、快速鑒定控制復(fù)雜農(nóng)藝性狀候選基因的方法，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李自超教授團(tuán)隊(duì)提出。水稻大部分農(nóng)藝性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，隨著測(cè)序技術(shù)和數(shù)量性狀定位分析方法的發(fā)展，大量水稻種質(zhì)資源深度測(cè)序的完成使得水稻種質(zhì)資源群體中存在的自然等位變異得以通過(guò)GWAS鑒定。但是，由于水稻基因組的LD衰減較慢，因此造成關(guān)聯(lián)分析的精度無(wú)法達(dá)到單基因的水平。李自超教授團(tuán)隊(duì)利用水稻種質(zhì)資源和海量SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)基因的挖掘，將GWAS與連鎖分析相結(jié)合，鑒定了2個(gè)控制水稻子粒長(zhǎng)度的新基因OsLG3b和OsLG3。Pool-seq混池測(cè)序，即混合樣本測(cè)序，其原理是假設(shè)每個(gè)樣本的檢測(cè)概率相等，理想情況下表型差異顯著的混合樣本，其相關(guān)基因等位基因頻率的差異也顯著。Pool-seq一般是選擇表型極端或目標(biāo)性狀具有差異的個(gè)體混合，構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，在混合樣本量足夠大且測(cè)序深度提高的情況下，能夠準(zhǔn)確評(píng)估等位基因頻率。QTG-Seq由QTL-Seq發(fā)展而來(lái)，能夠更快、更精確地進(jìn)行基因定位。Zhang等通過(guò)QTG-Seq，構(gòu)建2個(gè)親本的F2群體初步定位到4個(gè)株高相關(guān)QTL。之后構(gòu)建兩親本的BC1F1群體，并選擇其余3個(gè)QTL純合而目標(biāo)QTL雜合的單株繼續(xù)構(gòu)建BC2F2家系，從中篩選獲得近1 200個(gè)具有極端株高表型的單株作為混池。通過(guò)對(duì)極端表型單株混池進(jìn)行全基因組測(cè)序，并通過(guò)最大似然算法（smoothLOD）直接鑒定候選基因，僅用4個(gè)世代就從雙親組配的群體中挖掘出候選基因，極大地節(jié)省了時(shí)間[32]。

4 發(fā)展策略與展望

分子標(biāo)記技術(shù)是解析重要性狀基因遺傳效應(yīng)，分析基因間、基因與環(huán)境間互作的重要手段，在進(jìn)行數(shù)量性狀分析和分子標(biāo)記育種方面具有不可或缺的作用。創(chuàng)新分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)技術(shù)，獲得更多的分子標(biāo)記和有利用價(jià)值的新基因，明析基因功能，可以提高我國(guó)分子育種效率，逐步建立并完善植物基因組選擇[33］，并在植物育種中發(fā)揮重要作用。