瘤胃液移植技術及應用的研究進展

張定然，吳 燕，邢小光，徐鴻潤，齊智利

（華中農業(yè)大學動物科技學院，湖北武漢 430070）

瘤胃作為反芻動物特有的消化器官，棲息在瘤胃中數量巨大且復雜多樣的微生物群與宿主以共生關系構成了一個“復雜有機體”。瘤胃菌群可以降解牧草中難以被宿主消化分解的纖維素、半纖維素、木質素和果膠等復雜結構多糖[1]，產生宿主生長、維持、繁殖等生理活動所必需的營養(yǎng)物質，對反芻動物免疫功能和整體生產效率的維持發(fā)揮著至關重要的作用。瘤胃菌群會受到宿主的生理狀況、日糧、環(huán)境等多種因素影響，對瘤胃微生物群落進行干預調整來提高宿主飼料利用率、改善機體健康狀態(tài)、改變生產產品特點等。瘤胃液移植（Rumen Fluid Transplantation，RT）是指將供體動物瘤胃液所包含的微生物群落作為整體經過一定手段移植到受體瘤胃內，以改變或重塑受體動物瘤胃內的微生態(tài)結構[2]。本文從反芻動物瘤胃微生物的組成與功能、瘤胃液移植的方法及應用進行綜述，以期為后續(xù)通過瘤胃液移植改善腸道菌群紊亂、提高生產性能、治療營養(yǎng)代謝疾病等提供理論參考。

1 瘤胃微生物的組成與功能

1.1 瘤胃微生物的組成 瘤胃是一個復雜的動態(tài)生態(tài)系統(tǒng)，主要由厭氧細菌、原蟲、厭氧真菌、產甲烷古菌和噬菌體組成[3]。每毫升的瘤胃液中有1010～1011個細菌，占瘤胃微生物數量的95% 以上[4]。Henderson 等[5]對來自世界各地的742 個樣本進行了瘤胃和前腸微生物群落組成的測定，結果發(fā)現細菌中最豐富的7 種細菌組占所有細菌序列數據的67.1%，可以認為是瘤胃的“優(yōu)勢菌”，分別是普氏菌屬（Prevotella）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、未分類毛螺菌科（Lachnospiraceae）、疣微菌科（Rumin ococcaceae）、擬桿菌目（Bacteroidales）、梭菌目（Clostri diales）。瘤胃古細菌主要由嚴格厭氧的產甲烷的微生物組成，被稱為產甲烷菌，且大部分（92.3%）可分為3 個屬級類群，分別是甲烷短桿菌（Methanobrevibacter）（61.6%）、甲烷微菌屬（Methanomicrobium）（14.9%）、未被培養(yǎng)的瘤胃古細菌群（RCC）（15.8%）[6]。每毫升的瘤胃液中原蟲數是105～106個，雖然數量較少，但占瘤胃生物量近50%[7]，由纖毛蟲和鞭毛蟲組成，大多數是纖毛蟲，內毛蟲屬（Entodinium）是瘤胃原蟲的優(yōu)勢屬[8]。真菌可能占瘤胃微生物生物量的5%～20%[7]。

1.2 瘤胃微生物與宿主生產性能 瘤胃中復雜的共生菌群是飼料成分分解的主要原因，反芻動物約70% 的代謝能來源于飼料微生物發(fā)酵[9]。有多項研究表明，瘤胃微生物群與反芻動物的飼料效率[10]、產奶量和奶成分[11]等生產性能有關。Li[12]研究發(fā)現，低飼料效率肉牛中毛螺菌科（Lachnospiraceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）和韋榮球菌科（Veillonellaceae）的豐度顯著高于高飼料效率肉牛。Mu 等[13]對高產奶牛和低產奶牛的腸道細菌典型特征和瘤胃代謝物圖譜分析發(fā)現，與低產奶牛相比，高產奶牛的細菌豐富度和物種均勻度較低，但在門水平上，高產奶牛組變形桿菌門（Proteobacteria）豐度顯著增加，降低了擬桿菌門（Bacteroidetes）、微菌門（Verrucomicrobia）、廣古菌門（Euryarchaeota）、浮霉菌門（Planctomycetes）和綠彎菌門（Chloroflexi）豐度降低；而在屬水平，高產奶牛組瘤胃液中丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、毛螺菌屬（Lachnospira）和小桿菌屬（Dialister）含量顯著高于低產奶牛組。Jami 等[14]通過對奶牛的生產參數與瘤胃微生物的組成分析發(fā)現，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比率與牛奶日乳脂率密切相關。對不同飼料效率的牛瘤胃微生物群進行研究發(fā)現，不同組之間的厚壁菌門（Firmicutes）和黏膠球形菌門（Lentisphaerae），以及琥珀酸乳桿菌屬（Succiniclasticum）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和普氏菌屬（Prevotella）的種群數量發(fā)生了顯著變化，表明瘤胃菌群組成與結構影響肉牛的飼料效率[15]。研究表明，雖然奶牛的飼料消化率和產奶量相似，但其甲烷（CH4）的產生量不同，這與個體間的瘤胃菌群差異有關，與CH4高排放奶牛相比，CH4低排放奶牛的變形桿菌門（Proteobacteria）的豐度較高[16]。通過反芻動物瘤胃菌群與生產性能的相關性研究，可闡述不同菌群對生產性能的貢獻進而通過特定菌群進行精準調控。

1.3 瘤胃微生物與宿主健康 共生菌群在哺乳動物胃腸道中具有多重作用，其通過與黏膜表面的直接或間接作用而有益于宿主生理[17]。瘤胃在出生時是無菌狀態(tài)，分娩后，微生物在無菌的哺乳動物胃腸道中定殖。微生物定植是一個復雜的過程，受宿主與微生物之間的雙向互作，以及包括母體微生物群、分娩過程、飲食和抗生素等多種外部因素的影響。在最初定植之后，持續(xù)暴露于宿主特異性微生物不僅對于宿主黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟至關重要，而且對動物的營養(yǎng)和健康也至關重要[18]。黏膜免疫系統(tǒng)包括物理屏障（黏膜層、上皮）、化學屏障（抗菌肽、分泌型IgA）和模式識別受體[toll 樣受體（TLR）、NOD 樣受體]，以及一系列免疫細胞[19]。微生物組成在維持瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性方面起著重要作用，微生物-TLR-細胞因子軸參與了維持胃腸道生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[20]。瘤胃上皮-血管界面吸收微生物發(fā)酵產物，也作為選擇性屏障，防止細菌、細菌毒素和免疫原性因子的易位和全身性傳播。當瘤胃微生物失衡時瘤胃酸度和滲透壓增加，甚至導致上皮和血管內皮屏障完整性的破壞，從而促進細菌或細菌抗原進入門靜脈誘發(fā)局部或全身性炎癥[21]。瘤胃發(fā)育中的菌群定植過程是瘤胃功能實現的關鍵，而瘤胃功能是斷奶的先決條件，進而影響消化的效率和穩(wěn)定性。瘤胃發(fā)育不良或不足會對營養(yǎng)物的消化吸收產生不利影響，甚至會導致呼吸道疾病和腹瀉等疾病[22]。在瘤胃的早期發(fā)育中，微生物也發(fā)揮重大作用，其驅動的乙酸和丁酸的產生介導了瘤胃上皮中與生長相關信號通路的調控，促進了瘤胃上皮生長和乳頭形態(tài)發(fā)育[23]，進而提高幼齡反芻動物斷奶期對能量和營養(yǎng)物質的吸收和利用。

2 瘤胃液移植的方法

穩(wěn)定性和可塑性是瘤胃微生物的特點，穩(wěn)定性保證反芻動物正常的生理機能狀態(tài)和生產性能，可塑性為調控瘤胃微生物提供了條件。在人類和其他單胃動物的研究中，糞菌移植已經成功用于治療復發(fā)性艱難梭菌感染[24]、結腸炎[25]等，胃腸道微生物對于機體健康的作用越來越受到重視，糞菌移植成為治療腸道菌群失調的一種重要治療方法。瘤胃液移植相較于糞菌移植起步較晚，之前一直備受爭議，但是隨著對瘤胃微生物研究的深入，瘤胃液移植成為提高反芻動物生產性能，改善機體健康的可行方法。

瘤胃液移植沒有嚴格的執(zhí)行標準，應用目的不同時可采用不同的瘤胃液采集方式。當用于移植的瘤胃液需要量較少時，可以通過健康動物嘴里的反芻食團獲得，或者通過采樣胃管經反芻動物食管插入瘤胃中抽取[26]。對于移植瘤胃液需要量比較大時，一般將供體牛屠宰或者經過瘤胃瘺管來獲得移植的瘤胃液[27-28]。安裝有瘤胃瘺管的動物作為供體和受體，可以方便獲取大量的瘤胃液，且比未安裝瘤胃瘺管的動物通過采樣胃管獲取瘤胃液造成的應激小。需要注意的是，在屠宰場獲得的供體瘤胃需要提前進行篩選，以免引入禽型分支桿菌、沙門氏菌、隱孢子蟲或大腸桿菌等感染性病原體[26]。

用于移植的瘤胃液pH 應在5.5 或者更高，低pH會降低瘤胃液中的原蟲數量，且應避免使用泡沫較多的瘤胃液。收集好的瘤胃液用無菌紗布或大篩子過濾掉大顆粒物后，保證里面含有足量的細菌、原蟲和真菌。在條件允許的情況下，最好將處理后的瘤胃液立即移植給受體動物，建議在瘤胃液采集之后30 min 內[2]，同時操作要盡量迅速，減少受體牛的應激反應，注意動作輕柔，不要對腸道壁造成損傷。但也有研究將瘤胃液在冷凍條件下保存，使用凍干瘤胃液進行移植[29]。使用冷凍后的瘤胃液要注意厭氧條件下操作，避免損失過多的厭氧菌，影響移植結果。

3 瘤胃液移植的應用

3.1 瘤胃液移植對生產性能的調控 瘤胃微生物的組成和功能特點與反芻動物的生產性能密切相關，通過瘤胃液移植，能更加了解瘤胃微生物與宿主間的相互作用，更好發(fā)揮動物的生產性能。野牛與肉牛相比具有更強的消化纖維的能力，對低質量（粗蛋白質＜7%）日糧的利用能力更強[27]。Ribeiro 等[27]將野牛的瘤胃內容物2次移植到肉牛瘤胃中，替換了肉牛瘤胃中70%內容物，發(fā)現移植后肉牛的纖維消化率沒有改變，但改變了肉牛瘤胃的微生物組成和代謝，提高了蛋白質消化率和氮保留率，改變了揮發(fā)性脂肪酸的比例，改善了瘤胃發(fā)酵指標。He 等[30]將野牛瘤胃內容物移植給肉牛，結果表明移植有利于肉牛對纖維飼料的消化。蔣濤[2]將泌乳高峰期健康奶牛的瘤胃液移植給干奶期奶牛，發(fā)現受體瘤胃和直腸中微生物生態(tài)結構和相對成熟度迅速接近供體奶牛，奶牛食欲增強，采食行為變得積極，從而改善了機體的代謝。Weimer 等[31]將產奶效率不同的3 對奶牛進行大約95% 瘤胃內容物的交換，發(fā)現瘤胃液交換會導致交換雙方產奶效率的改變，提示通過瘤胃液移植可以改善奶牛的產奶效率。

3.2 瘤胃液移植對幼齡動物生長發(fā)育的影響 反芻動物早期胃腸道微生物定植對宿主胃腸道發(fā)育和成熟至關重要，許多研究都傾向于通過早期飲食干預來調控牲畜的胃腸微生物組，以改善宿主的營養(yǎng)和健康，近年來瘤胃液移植對早期微生物定植的作用受到重視。Yu 等[32]將從成年綿羊收集的瘤胃液經軟硅膠管多次接種（斷奶前或斷奶期間）到幼羊羔的瘤胃，影響了羔羊瘤胃微生物的聚集，斷奶前接種促進羊肚菌（Moryella）、無針毛菌屬（Acetitomaculum）、毛細菌屬4（Tyzzerella 4）、琥珀色毛細菌屬（Succiniclasticum）等的定植，斷奶期接種促進了乳酸菌屬（Succiniclasticum）、普雷沃氏菌科UCG-003（PrevotellaceaeUCG-003）、普氏菌1（Prevotella 1）等的定植。張鑫[33]給新生犢牛多次灌服健康成年牛的瘤胃液，發(fā)現接種瘤胃微生物降低了犢牛的腹瀉率，顯著改變了瘤胃發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的比例，且趨向于促進瘤胃乳頭發(fā)育的發(fā)酵模式，還促進了十二指腸的發(fā)育。Yu 等[29]的研究表明，將從成熟反芻動物身上獲得的凍干瘤胃液接種給新生羔羊，顯著提高了斷奶前羔羊對飼料干物質和粗蛋白質的表觀消化率，且斷奶后羔羊對粗蛋白質的表觀消化率仍高于對照羔羊，還促進了羔羊下消化道（盲腸和結腸）和肝臟的發(fā)育。綜上，幼齡反芻動物的瘤胃微生物群具有相當大的可塑性，接種成年動物的瘤胃液可以促進形成完整成熟的瘤胃微生物區(qū)系，潛在促進動物生長。

3.3 瘤胃液移植對消化紊亂的影響 酸中毒是反芻動物常見的瘤胃消化系統(tǒng)疾病，能夠擾亂瘤胃微生物穩(wěn)態(tài)和降低瘤胃上皮功能，最終導致動物生產性能顯著下降，帶來巨大的經濟損失。目前，瘤胃液體移植已成功應用于治療反芻動物的消化紊亂，但其在瘤胃微生物穩(wěn)態(tài)和宿主功能中的作用機制尚不清楚。Liu 等[28]對低聚果糖輸注誘發(fā)瘤胃乳酸性酸中毒的綿羊進行瘤胃液移植，結果發(fā)現移植可引起瘤胃發(fā)酵的動態(tài)變化，增加總揮發(fā)性脂肪酸的濃度，但降低瘤胃中乳酸和脂多糖（LPS）含量，減輕急性瘤胃酸中毒引起的瘤胃上皮的損傷，使機體從酸中毒狀態(tài)加速恢復到與供體相似的健康水平，促進了瘤胃細菌穩(wěn)態(tài)的快速重建。Jasmin 等[34]對2 只綿羊僅飼喂小顆粒飼料，導致其出現瘤胃酸中毒相一致的臨床體征，并伴有瘤胃運動性降低、厭食、瘤胃原蟲數量下降等，給試驗羊移植正常健康羊的瘤胃液后，試驗羊的瘤胃消化功能很快完全恢復。瘤胃液移植還可作為皺胃左移恢復手術之后的輔助治療。Rager 等[35]發(fā)現，術后進行瘤胃液移植奶牛的干物質采食量和產奶量高于對照組，且酮尿癥程度更低。

對經典飲食（高精料/低粗料）引起的乳脂降低的奶牛進行瘤胃液移植，發(fā)現乳脂降低牛恢復正常乳脂的速度有所加快，說明瘤胃微生物菌群移植可有效干預飲食引起的乳脂減少的代謝紊亂[36]。瘤胃液移植還對抗生素導致的奶牛胃腸道微生物紊亂具有改善作用[37]，這為解決受到抗生素干擾的胃腸道菌群恢復提供了思路。對經過長時間運輸的牛進行瘤胃液口服移植能夠提高其干物質采食量，降低運輸應激的影響[38]。

4 小 結

反芻動物瘤胃微生物群結構和功能的變化對其健康和生產性能有重要影響。通過瘤胃液移植改變或重塑受體瘤胃或腸道微生物群落結構，對反芻動物的生產性能、消化紊亂和幼齡動物生長發(fā)育等方面都有著積極的作用。瘤胃液移植雖然目前還處于起始階段，但其作為重要的營養(yǎng)調控手段越來越受到重視。瘤胃液移植過程中，理想供體的選擇、瘤胃微生物的宿主特異性、供體腸道微生物結構的抗性、微生物間的相互作用及不同種屬微生物瘤胃定植能力的差異等問題都需要進一步研究，以提高移植效率。瘤胃液移植發(fā)揮作用的同時，應對供體及受體動物移植前后的微生物區(qū)系進一步分析，更好地了解發(fā)揮功能的特異性菌群及宿主與微生物間的相互作用，以便通過胃腸道微生物區(qū)系對反芻動物進行更加精準的調控。隨著多組學技術和高通量測序等生物技術手段的發(fā)展，以及對瘤胃液中具有特定功能的菌群進行選擇及體外培養(yǎng)研究，瘤胃微生物的定植發(fā)育和結構功能將更加明確，瘤胃液移植也將走向特異性功能菌群移植的方向。