雨生紅球藻積累蝦青素的分子基礎(chǔ)與人工誘導(dǎo)調(diào)控研究進(jìn)展

竇 勇，吳 琳，閆永芳，任虹燁，陳家宇，喬之怡，翟勝利，周文禮

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384； 2.天津現(xiàn)代晨輝科技集團(tuán)，天津 301802 )

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細(xì)胞微藻，在分類(lèi)學(xué)上屬綠藻門(mén)、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬[1]。其生活史主要分為游動(dòng)細(xì)胞階段和不動(dòng)細(xì)胞階段。在外界環(huán)境條件適宜時(shí)，微藻以游動(dòng)狀態(tài)存在，依靠?jī)蓷l頂生、等長(zhǎng)的鞭毛運(yùn)動(dòng)，這一階段的細(xì)胞大多呈綠色，此時(shí)微藻生長(zhǎng)旺盛，生物量積累迅速[2]。當(dāng)雨生紅球藻處于高光照度、高鹽度及營(yíng)養(yǎng)缺乏的脅迫條件時(shí)，細(xì)胞以紅色厚壁孢子形式存在，此階段細(xì)胞鞭毛脫落，運(yùn)動(dòng)能力喪失，開(kāi)始逐漸合成并積累蝦青素[3]。

蝦青素是一種脂溶性的次級(jí)類(lèi)胡蘿卜素，屬于萜烯類(lèi)的不飽和化合物[4]。蝦青素是目前為止在自然界有機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強(qiáng)的物質(zhì)，它清除自由基和單線態(tài)氧淬滅的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維生素E，比玉米黃質(zhì)、番茄紅素及β胡蘿卜素等常見(jiàn)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力高10倍以上，此外蝦青素還具有抑制腫瘤、提高免疫力的作用，目前被用作保健品輔料和食品添加劑[5-7]。蝦青素還有良好的著色效果，可以進(jìn)入生物體并貯存在組織中，農(nóng)業(yè)部2003年[318]號(hào)公告中指定天然蝦青素為水產(chǎn)動(dòng)物唯一著色劑[8-9]。雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量占細(xì)胞干質(zhì)量的1.5%～4.0%，而且全部是高生物活性的3S，3′S形態(tài)，因此被公認(rèn)為是自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最佳“生物反應(yīng)器”[10]。深入了解雨生紅球藻合成、積累蝦青素的分子基礎(chǔ)，探索人工誘導(dǎo)雨生紅球藻合成蝦青素的技術(shù)手段，對(duì)于利用雨生紅球藻這一“生物反應(yīng)器”生產(chǎn)天然蝦青素具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 雨生紅球藻積累蝦青素的分子基礎(chǔ)

雨生紅球藻在脅迫作用下合成蝦青素的生物化學(xué)途徑雖已得到充分認(rèn)識(shí)，但該過(guò)程同時(shí)伴隨著細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變以及生理生化、遺傳網(wǎng)絡(luò)、代謝通路層面的變化，而且這些變化穿插發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，并受到基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾等不同層次的調(diào)節(jié)[11-14]。有文獻(xiàn)指出，通過(guò)蝦青素關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控及酶蛋白翻譯后的活性調(diào)控是實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻蝦青素誘導(dǎo)合成的主要機(jī)制[15]。由此看來(lái)，雨生紅球藻合成蝦青素的生理代謝過(guò)程是極其復(fù)雜的，許多研究人員對(duì)此進(jìn)行了深入研究，逐漸對(duì)該過(guò)程的代謝、遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有了較為清晰的認(rèn)識(shí)，但其中還有許多問(wèn)題目前仍無(wú)法清晰解釋[16-20]。

1.1 與雨生紅球藻積累蝦青素相關(guān)的基因、調(diào)控元件與轉(zhuǎn)錄因子

1.1.1 雨生紅球藻全基因組分析

有機(jī)體的所有生命活動(dòng)均可以從基因中得到答案，因此高質(zhì)量的生物全基因組數(shù)據(jù)是探索有機(jī)體生命活動(dòng)規(guī)律最重要的資料。深圳大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)[21]首次完成了雨生紅球藻全基因組測(cè)序、組裝和注釋工作，生成了一份669.0 Mb規(guī)模的基因組草圖(scaffold N50為288.6 kb)，并預(yù)測(cè)了18 545個(gè)基因。研究者還從14個(gè)代表性藻類(lèi)中建立了穩(wěn)健的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)種類(lèi)，并借助轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示了雨生紅球藻中一些涉及合成、積累和調(diào)節(jié)蝦青素生產(chǎn)的新型潛在基因，還在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生了高可信度的包含18 483個(gè)轉(zhuǎn)錄本的同工型水平參考轉(zhuǎn)錄組，并通過(guò)選擇性剪接分析證實(shí)內(nèi)含子保留是最普遍的模式，該基因組以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為理論研究和商業(yè)生產(chǎn)提供了可靠的基礎(chǔ)資料。

1.1.2 雨生紅球藻積累蝦青素相關(guān)的調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子

全基因組數(shù)據(jù)為厘清雨生紅球藻合成蝦青素的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了最基礎(chǔ)的資料，而對(duì)基因組精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析為詳細(xì)描摹該過(guò)程提供了更多的細(xì)節(jié)信息，該方面的工作主要集中于對(duì)關(guān)鍵酶基因非編碼DNA序列(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)等順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子等反式作用元件的研究。Wei等[22]利用凝膠阻滯的方法研究了雨生紅球藻中bkt基因309 bp啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)了特異性的核蛋白結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步的分析證實(shí)該位點(diǎn)區(qū)域存在響應(yīng)環(huán)境脅迫因子、對(duì)香豆酸及激素反應(yīng)的G-box。孟春曉[23]借助基因組上游步移技術(shù)克隆了雨生紅球藻bkt基因兩個(gè)不同的5′上游側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)其類(lèi)似于高等植物脅迫誘導(dǎo)基因中的順式作用元件；定點(diǎn)突變結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APE-like(藍(lán)光調(diào)控元件)對(duì)于bkt基因自身的轉(zhuǎn)錄可能存在影響。進(jìn)一步分別針對(duì)這兩個(gè)不同的5′上游側(cè)翼序列構(gòu)建了一系列缺失突變體，驗(yàn)證了其中可能包含的增強(qiáng)子區(qū)或抑制子區(qū)，同時(shí)證明了1.5 kb大小的5′上游側(cè)翼序列對(duì)應(yīng)ATG下游的第一個(gè)內(nèi)含子可能是控制bkt基因轉(zhuǎn)錄的抑制子。Gao等[24]克隆了雨生紅球藻中crtO基因的3個(gè)不同大小的5′上游側(cè)翼序列(1.1、1.9 kb和2.2 kb)，并利用生物信息學(xué)方法分別預(yù)測(cè)并比較了這3段序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者具有與高等植物相類(lèi)似的順式作用元件，如脫落酸反應(yīng)元件(ABRE)、干燥或低溫反應(yīng)元件(DRE/C-repeat)、幾種光反應(yīng)元件(G1-box，GAG-motif，l-boxand ATC-motif)、熱激反應(yīng)元件(HSE)、機(jī)械傷害反應(yīng)元件(WUN-motif)、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件(TGA-element)、茉莉酸甲酯反應(yīng)元件(TGACG-element)和反式作用因子MYB蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(MBS和MRE)等，但三者均不具有典型的TATA和CCAAT框，結(jié)果預(yù)示了雨生紅球藻蝦青素合成過(guò)程中crtO基因調(diào)控方式的多樣化。寧晶晶[25]通過(guò)對(duì)小RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，研究了雨生紅球藻蝦青素合成中的miRNA-TF共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNA和9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素和油脂合成調(diào)控，并進(jìn)一步證實(shí)蝦青素和油脂合成途徑的酶基因既受轉(zhuǎn)錄因子的正調(diào)控，也受miRNA的負(fù)調(diào)控，參與兩個(gè)途徑的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA既有相對(duì)獨(dú)立性，還存在著一定的交互作用。脅迫條件下雨生紅球藻積累蝦青素的過(guò)程十分復(fù)雜，除了代謝途徑和遺傳網(wǎng)絡(luò)方面的改變，表觀遺傳學(xué)層面的變化也起了重要作用。張克亞等[26]對(duì)缺氮脅迫0、24、72 h的雨生紅球藻基因組DNA進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析，共得到了291個(gè)甲基化多態(tài)性位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)基因組甲基化率伴隨蝦青素合成發(fā)生顯著變化，這表明DNA甲基化調(diào)節(jié)方式的改變是蝦青素積累過(guò)程中的一種重要調(diào)控模式。

1.2 與雨生紅球藻積累蝦青素相關(guān)的重要蛋白質(zhì)

根據(jù)中心法則，有機(jī)體生命活動(dòng)的最終體現(xiàn)者是基因的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)，因此對(duì)生命過(guò)程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的解析是探求生命活動(dòng)規(guī)律的重要方法。光是環(huán)境中重要的信號(hào)因子，對(duì)真核微藻的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，光不僅提供光合作用所需要的能量，自身也蘊(yùn)含光質(zhì)、光強(qiáng)和光周期等信息[27]。真核微藻通過(guò)光受體感知光照信號(hào)，并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控多種生理過(guò)程，包括形態(tài)建成、生物節(jié)律、趨光性以及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成與積累等。有學(xué)者利用同源克隆和RACE技術(shù)結(jié)合的方法獲得了藍(lán)光受體向光素PHOT的cDNA全長(zhǎng)，并借助生物信息學(xué)工具進(jìn)行了其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面的分析研究[28-29]。近年來(lái)研究人員開(kāi)發(fā)出一系列光遺傳學(xué)元件，通過(guò)光敏蛋白響應(yīng)特定波長(zhǎng)的光，經(jīng)過(guò)一系列構(gòu)象改變、蛋白間可逆結(jié)合以及聚合反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)特異性生理反應(yīng)，包括(去)激活特異性蛋白活動(dòng)、激活或抑制轉(zhuǎn)錄、亞細(xì)胞定位、局部活性氧生產(chǎn)和其他功能，為研究雨生紅球藻的光響應(yīng)生理及機(jī)制提供了潛在的工具[30]。顧文輝[31]通過(guò)比較雨生紅球藻和鹽藻強(qiáng)光響應(yīng)下類(lèi)囊體膜蛋白組的變化，發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻對(duì)強(qiáng)光脅迫的適應(yīng)性更強(qiáng)，并推測(cè)雨生紅球藻可能在適應(yīng)強(qiáng)光的過(guò)程中重新調(diào)整了碳流向，并通過(guò)多種機(jī)制參與光保護(hù)以及蝦青素的生物合成。范勇等[32]通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻的質(zhì)體內(nèi)確實(shí)存在質(zhì)體球滴結(jié)構(gòu)——plastoglobules，并通過(guò)RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，從雨生紅球藻cDNA文庫(kù)中克隆到與編碼plastoglobules的結(jié)構(gòu)蛋白Plastoglobulin具有高度同源性的Hpgp基因序列全長(zhǎng)，并進(jìn)一步利用原核表達(dá)系統(tǒng)將該編碼基因進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，然后用His-Tag蛋白分離純化得到了目標(biāo)蛋白。王坤鵬[33]對(duì)脅迫早期的雨生紅球藻進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)高響應(yīng)強(qiáng)光和醋酸鈉脅迫的HpGNAT-1基因進(jìn)行分子克隆及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為493 bp，同源性分析表明，HpGNAT-1基因的表達(dá)產(chǎn)物可能為N-乙?；D(zhuǎn)移酶，該基因可翻譯成含163個(gè)氨基酸且可能定位于細(xì)胞質(zhì)的蛋白，并推測(cè)該蛋白可能存在4個(gè)α-螺旋和7個(gè)β-折疊，具有N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶家族保守結(jié)構(gòu)域和Rim Ⅰ結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)，并可能通過(guò)與輔酶A結(jié)合作用于核糖體蛋白S18亞基對(duì)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。

類(lèi)泛素化蛋白修飾分子(SUMO)化修飾是一種蛋白翻譯后的修飾方式，其在蛋白質(zhì)之間相互作用、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、轉(zhuǎn)錄因子活性等方面發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子LBD30通過(guò)SIZ1介導(dǎo)的類(lèi)泛素化蛋白修飾分子化修飾作用于擬南芥纖維細(xì)胞次生細(xì)胞壁加厚過(guò)程，證實(shí)LBD30的類(lèi)泛素化蛋白修飾分子化修飾直接對(duì)纖維細(xì)胞壁加厚的轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行調(diào)控，類(lèi)泛素化蛋白修飾分子化的LBD30促進(jìn)細(xì)胞壁加厚的轉(zhuǎn)錄程序啟動(dòng)[34]。該研究首次發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)類(lèi)泛素化蛋白修飾分子化修飾在調(diào)控次生細(xì)胞壁形成中的重要功能，揭示了次生細(xì)胞壁形成多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)新途徑。雖然是以高等植物擬南芥為材料，但是該信號(hào)通路具有較高的跨物種保守性，因此為解釋雨生紅球藻響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞壁加厚的生理過(guò)程提供了線索和方向。

2 雨生紅球藻積累蝦青素的人工誘導(dǎo)調(diào)控研究

發(fā)生在雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素生物合成途徑雖然已經(jīng)得到充分認(rèn)識(shí)，但是該途徑的自然合成效率以及底物、能源的利用率均很低，是制約蝦青素規(guī)?；a(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的“瓶頸”問(wèn)題，因此培養(yǎng)環(huán)境脅迫因子調(diào)控、通過(guò)物理和化學(xué)手段進(jìn)行人工誘變育種、無(wú)機(jī)和有機(jī)碳源加富以及外源刺激物誘導(dǎo)成為提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素能力的常用方法[35-37]。

2.1 培養(yǎng)環(huán)境調(diào)控對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.1.1 光照對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

光照是微藻生命活動(dòng)不可缺少的環(huán)境因子，對(duì)光照條件進(jìn)行有效控制可以促進(jìn)雨生紅球藻合成、積累蝦青素。有研究證實(shí)，不同光質(zhì)對(duì)雨生紅球藻的誘導(dǎo)效果不同[38]，紅光有利于雨生紅球藻生長(zhǎng)，藍(lán)光有助于雨生紅球藻積累蝦青素，此外連續(xù)光照較光暗交替更利于蝦青素積累[7]。江紅霞等[39]研究了不同光強(qiáng)和光周期對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響，發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量隨光強(qiáng)上升而提高，在270 μmol/(m2·s)的光強(qiáng)條件下連續(xù)照射10 d雨生紅球藻內(nèi)的蝦青素水平和抗氧化能力最高。Ma等[40]使用150 μmol/(m2·s)的白光LED和70 μmol/(m2·s)的藍(lán)光LED對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行脅迫，結(jié)果表明，兩種光照條件下微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素和總脂肪酸含量顯著上升，與色素合成及脂質(zhì)積累相關(guān)的基因psy、crtO、bkt2、lcy、crtR-B、fata和dgat表達(dá)量明顯上調(diào)。

2.1.2 鹽度對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

有研究表明，高鹽度脅迫是刺激雨生紅球藻積累蝦青素的有效手段[41-43]。黃水英等[44]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不大于10 g/L的NaCl可以顯著促進(jìn)雨生紅球藻合成并積累蝦青素。Boussiba等[45]證實(shí)，將雨生紅球藻培養(yǎng)基中的NaCl含量提高3倍時(shí)，微藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素水平較原來(lái)提升了121%。江紅霞等[46]發(fā)現(xiàn)，使用0.12 mol/L的NaCl處理雨生紅球藻，可以使其細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量、非特異性免疫活力以及與蝦青素合成相關(guān)的lcy、crtR-B和bkt基因表達(dá)量顯著提高，證實(shí)了雨生紅球藻在高鹽脅迫下主要是通過(guò)提高蝦青素合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)促進(jìn)蝦青素合成，并與非特異性免疫系統(tǒng)中的抗氧化酶互相協(xié)作，降低細(xì)胞遭受高鹽脅迫引起的損傷。雖然高鹽度會(huì)促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素，但是鹽度過(guò)高會(huì)影響微藻正常的生命活動(dòng)，因此在實(shí)際操作中需要在雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累之間權(quán)衡選擇合適的處理鹽度。

2.1.3 營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

營(yíng)養(yǎng)缺乏作為環(huán)境脅迫因子，可以誘導(dǎo)雨生紅球藻合成與積累蝦青素，而缺素培養(yǎng)在天然蝦青素生產(chǎn)過(guò)程中也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。楊瑾等[47]發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻CG-06株細(xì)胞內(nèi)的色素積累量和積累速率均與初始硝態(tài)氮含量呈反比，缺氮條件下雨生紅球藻CG-06積累蝦青素的峰值時(shí)間較對(duì)照組提前6 d，峰值水平較對(duì)照組提高0.78 μg/mg。莊惠如等[48]將BBM培養(yǎng)基中的氮源NaNO3質(zhì)量濃度減半時(shí)(0.13 g/L)，發(fā)現(xiàn)對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞增殖和蝦青素累積均有利，在高光強(qiáng)下進(jìn)一步進(jìn)行氮、磷饑餓脅迫時(shí)，微藻細(xì)胞分裂明顯受到抑制，但細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量分別較對(duì)照組提高141.0%和60.5%，色素累積高峰也提前2～4 d，顯示了營(yíng)養(yǎng)虧缺對(duì)蝦青素合成與積累的促進(jìn)作用。雖然營(yíng)養(yǎng)虧缺有利于雨生紅球藻積累蝦青素，但有學(xué)者證實(shí)，當(dāng)培養(yǎng)體系中同時(shí)缺少磷、鎂和鐵元素時(shí)，雨生紅球藻細(xì)胞光化學(xué)效率下降，光系統(tǒng)能量分配發(fā)生改變，生長(zhǎng)受到抑制[49]。由此看來(lái)，不同元素在雨生紅球藻生命活動(dòng)中的作用不同，缺氮培養(yǎng)是誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素的適宜途徑，而磷與金屬元素在雨生紅球藻培養(yǎng)中是不可缺少的。

2.1.4 雨生紅球藻積累蝦青素的培養(yǎng)工藝優(yōu)化

培養(yǎng)條件下影響雨生紅球藻積累蝦青素的環(huán)境因子很多，許多學(xué)者對(duì)雨生紅球藻的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在確定最有利于蝦青素積累的培養(yǎng)條件組合。李嘉儀等[50]研究了光照強(qiáng)度、NaNO3濃度和NaCl濃度對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的作用，發(fā)現(xiàn)脅迫因子的影響能力為NaCl濃度>光照強(qiáng)度>NaNO3濃度，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到積累蝦青素的最佳條件，此時(shí)蝦青素產(chǎn)量為6.8 mg/L。Su等[51]評(píng)估了乙酸鹽、Fe2+和強(qiáng)光3種脅迫條件的各種組合對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響，并基于GC-MS的代謝組測(cè)定和加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)構(gòu)建了代謝網(wǎng)絡(luò)，為人工誘導(dǎo)雨生紅球藻合成與積累蝦青素提供了一定的數(shù)據(jù)支持。陶云瑩[52]研究了多種環(huán)境因子對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)、蝦青素及內(nèi)源激素積累的影響，結(jié)果表明，“23 ℃+200 μmol/(m2·s)”的培養(yǎng)條件最適合雨生紅球藻生長(zhǎng)，而“27 ℃+200 μmol/(m2·s)”最適合蝦青素和內(nèi)源脫落酸合成，此外酸堿脅迫都能促進(jìn)雨生紅球藻中脫落酸的積累，但是弱堿性環(huán)境適合微藻生長(zhǎng)，而堿性環(huán)境適合蝦青素的積累。Wan等[53]創(chuàng)造性地提出了“異養(yǎng)—稀釋—光誘導(dǎo)”的串聯(lián)培養(yǎng)模式，首先通過(guò)異養(yǎng)培養(yǎng)提高雨生紅球藻細(xì)胞密度，然后稀釋至合適密度并切換至微藻適應(yīng)的環(huán)境，最后使用高光照誘導(dǎo)微藻積累蝦青素，通過(guò)此種策略每升培養(yǎng)液中的雨生紅球藻細(xì)胞干質(zhì)量可以達(dá)26 g，在異養(yǎng)期微藻生產(chǎn)力高達(dá)64.1 mg/(L·h)，此時(shí)微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的4.6%。

2.2 人工誘變對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.2.1 物理誘變因素對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

在實(shí)際操作中常用高能射線、激光、紫外線和低溫等離子體對(duì)雨生紅球藻基礎(chǔ)藻株進(jìn)行誘變育種，以獲得高積累蝦青素和油脂等次級(jí)代謝產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)藻株。李珂[54]使用60Co-γ射線核誘變顯著提高了雨生紅球藻的生長(zhǎng)固碳速率和蝦青素含量，突變?cè)逯甑纳L(zhǎng)速率較野生株提高了28.6%，而蝦青素質(zhì)量濃度和油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別由19.5 mg/L和36.1%提高至46.0 mg/L和45.9%。劉京華[55]采用大氣壓介質(zhì)阻擋放電(DBD)對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘變以獲得髙產(chǎn)蝦青素的突變?cè)逯?，并建立了基于紅外和拉曼顯微光譜成像技術(shù)的高產(chǎn)蝦青素突變?cè)逯昕鞕z方法，能夠在微觀尺度上對(duì)蝦青素等次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速定量分析。田燕[56]采用Nd：YAP激光為誘變劑，獲得了生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、目標(biāo)產(chǎn)物含量高的優(yōu)良雨生紅球藻藻株。劉峰[57]采用紫外線誘變的方法，獲得了兩株生物量和蝦青素含量均較高的突變?cè)逯辏c出發(fā)藻株比，突變株的生長(zhǎng)速度與蝦青素含量提高了4.5%～18.9%。Chen等[58]使用低溫等離子體處理得到高積累蝦青素的雨生紅球藻突變株M3，M3具備更高的CO2同化率，而qRT-PCR結(jié)果顯示，M3通過(guò)調(diào)節(jié)葉綠體呼吸途徑和提高非光合色素(葉黃素、β胡蘿卜素和蝦青素)含量有效地緩解了光氧化損傷。韓國(guó)研究人員使用100 mA(25 V電壓)的電流對(duì)培養(yǎng)瓶中的雨生紅球藻進(jìn)行持續(xù)刺激，發(fā)現(xiàn)處理組的微藻細(xì)胞密度較對(duì)照組提高1.2倍，蝦青素產(chǎn)量提高10%，最高可達(dá)32.6 mg/L[59]。

2.2.2 化學(xué)誘變因素對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

化學(xué)誘變相比于物理誘變，能耗和成本較低，是改善微藻品系經(jīng)濟(jì)性狀的理想手段，常用的誘變劑有烷化劑和疊氮化物等。沈國(guó)明等[60]用不同質(zhì)量濃度的烷化劑——亞硝基胍對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)2.5 g/L的亞硝基胍誘導(dǎo)下，雨生紅球藻的增長(zhǎng)速率和細(xì)胞內(nèi)積累的蝦青素質(zhì)量濃度最高，分別為(0.381±0.0289) mg/L和(2.9±0.29) mg/L，而3.5 g/L的亞硝基胍會(huì)嚴(yán)重影響雨生紅球藻的葉綠素合成，造成藻體脫色，由此可見(jiàn)選擇適宜的質(zhì)量濃度是進(jìn)行化學(xué)誘變的關(guān)鍵步驟。孫延紅[61]用甲基磺酸乙酯和疊氮鈉對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.02%甲基磺酸乙酯誘變10 d后，分離得到的誘變株的蝦青素水平較出發(fā)株提高40%，而經(jīng)200 mg/L 疊氮鈉誘變24 h后，分離得到的誘變株的生物總量較出發(fā)株提高43%，而蝦青素產(chǎn)量未顯著提升，這說(shuō)明不同的誘變劑可能具有不同的作用機(jī)制，其對(duì)雨生紅球藻的影響也表現(xiàn)出明顯的差異。

2.3 外加CO2或其他有機(jī)碳源物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.3.1 外加CO2對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

雨生紅球藻除了可以進(jìn)行光合自養(yǎng)生長(zhǎng)之外，還能在外加CO2的條件下提高光合速率和能量生產(chǎn)，從而加快生物量和次級(jí)代謝產(chǎn)物積累。Cheng等[62]在雨生紅球藻培養(yǎng)體系中外加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CO2處理，發(fā)現(xiàn)在添加6% CO2的條件下，雨生紅球藻的生物量和積累蝦青素的水平最高。Christian等[63]在雨生紅球藻紅色細(xì)胞階段將CO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至5%和15%，改變了培養(yǎng)體系的C、N平衡，此時(shí)雨生紅球藻積累了較對(duì)照組高2～3倍的蝦青素。李珂[54]發(fā)現(xiàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15% CO2誘導(dǎo)時(shí)，雨生紅球藻代謝通路中的碳固定、糖酵解、丙酮酸代謝、脂肪酸和類(lèi)胡蘿卜素合成途徑比空氣條件下明顯增強(qiáng)，與油脂代謝和蝦青素合成相關(guān)的酶表達(dá)量上調(diào)2.9～18.4倍，而最終收獲的蝦青素和油脂含量分別達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的3.6%和31.8%。以上研究結(jié)果反映了不同雨生紅球藻株對(duì)CO2耐受性的差異，也提示研究者在實(shí)際操作中要根據(jù)研究對(duì)象自身生理特性的差異選擇適宜的CO2添加水平。

2.3.2 外加其他有機(jī)碳源物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

雨生紅球藻在外源有機(jī)碳源存在的情況下可以進(jìn)行異養(yǎng)生活，提高自身生物量和產(chǎn)物積累，因此添加外源碳源是促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)和積累蝦青素的有效手段。陳俊琳[64]以乙酸鈉和丙酮酸鈉作為外加碳源，并設(shè)計(jì)不同的添加策略，結(jié)果表明，同時(shí)添加兩種碳源時(shí)，雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素質(zhì)量濃度為10.836 mg/L，而首先添加丙酮酸鈉作為轉(zhuǎn)化碳源，轉(zhuǎn)化8 d后更換乙酸鈉為轉(zhuǎn)化碳源時(shí)，雨生紅球藻蝦青素質(zhì)量濃度為10.887 mg/L。有研究表明，添加外源葡萄糖有助于促進(jìn)雨生紅球藻生長(zhǎng)和積累蝦青素，同時(shí)還可以提高微藻細(xì)胞中內(nèi)源激素如脫落酸、赤霉素和吲哚乙酸的合成[52]。

2.4 外源刺激物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

2.4.1 外源有機(jī)物對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

使用小分子有機(jī)物作為外源刺激物質(zhì)對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而改變微藻的代謝途徑以促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成，是獲得蝦青素和脂質(zhì)等次級(jí)代謝產(chǎn)物的常用手段。尚敏敏等[65]研究證實(shí)，添加外源黃腐酸可以顯著影響雨生紅球藻生長(zhǎng)和蝦青素積累；當(dāng)黃腐酸質(zhì)量濃度為5 mg/L，藻細(xì)胞生物量達(dá)到了79.39 mg/(L·d)，蝦青素質(zhì)量濃度達(dá)20.82 mg/L，分別較對(duì)照提高4.25%和86.89%；當(dāng)黃腐酸質(zhì)量濃度為10 mg/L，藻細(xì)胞的生物量產(chǎn)率和蝦青素產(chǎn)量分別較對(duì)照提高5.44%和9.78%。岳陳陳等[66]發(fā)現(xiàn)，在高光照度和缺氮脅迫條件下，外源添加10 μmol/L褪黑素可有效提高雨生紅球藻LUGU中蝦青素的含量，最高可達(dá)31.32 mg/g，是對(duì)照組的2.36倍，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平受到抑制，而信號(hào)分子一氧化氮和水楊酸含量顯著上調(diào)，此外dxs基因表達(dá)水平較對(duì)照組明顯提高，說(shuō)明在非生物脅迫條件下，雨生紅球藻中蝦青素的大量積累可能與外源褪黑素調(diào)控細(xì)胞內(nèi)活性氧、信號(hào)分子及基因表達(dá)有關(guān)。Ding等[67]發(fā)現(xiàn)，叔丁基羥基茴香醚處理可以使雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素的含量較對(duì)照提高2.17倍，脂質(zhì)含量提高1.22倍，叔丁基羥基茴香醚處理可同時(shí)降低微藻碳水化合物和蛋白質(zhì)合成，并延遲葉綠素降解；后續(xù)的代謝組學(xué)分析表明，叔丁基羥基茴香醚上調(diào)并激活了涉及細(xì)胞基礎(chǔ)代謝和信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的生物過(guò)程(如糖酵解、三羧酸循環(huán)，氨基酸代謝和磷脂酰肌醇信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng))，從而增強(qiáng)了微藻的蝦青素和脂質(zhì)積累能力。Liu等[68]發(fā)現(xiàn)，0.4%的乙醇通過(guò)誘導(dǎo)雨生紅球藻的茉莉酸甲酯通路，引發(fā)微藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和生理屬性改變，同時(shí)顯著提高細(xì)胞內(nèi)蝦青素積累，進(jìn)一步的研究證實(shí)蝦青素的積累抵消了乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化脅迫。Lu等[69]用外源植物激素甲基茉莉酮酸酯和赤霉素處理雨生紅球WB-1藻株，發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素水平顯著提高；通過(guò)分子生物學(xué)手段在bkt1基因的5′側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)了典型的赤霉素A3響應(yīng)順式元件；結(jié)果表明，雨生紅球藻合成蝦青素的過(guò)程可能受到內(nèi)、外源激素的調(diào)控。

2.4.2 外源無(wú)機(jī)物對(duì)雨生紅球藻積累蝦青素的影響

近年來(lái)的研究表明，一些無(wú)機(jī)小分子可以作為雨生紅球藻合成蝦青素的誘導(dǎo)因子，起到顯著促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素的作用。有研究表明，F(xiàn)e2+和二鹽酸鹽可以分別為蝦青素合成提供氧化誘導(dǎo)劑HO·和AO2·，從而提高雨生紅球藻積累蝦青素的水平[70]。于馨恒[71]發(fā)現(xiàn)，H2O2和Mg2+處理可以顯著提高雨生紅球藻的生物量和蝦青素積累。Li等[72]證實(shí)，3.0 mmol/L的Na2WO4是促進(jìn)雨生紅球藻積累青蝦素的最適濃度，此時(shí)微藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量為(49.41±0.13) pg/細(xì)胞，而與蝦青素合成相關(guān)的ipi、psy和bkt基因表達(dá)量也顯著提高。外源無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)大多是雨生紅球藻氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，它們?cè)谟|發(fā)雨生紅球藻抗逆反應(yīng)的同時(shí)促進(jìn)其合成和積累蝦青素，抵御氧化脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害。

3 展 望

目前雖然已經(jīng)掌握了關(guān)于雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素生物合成與積累的大量信息，但仍有許多具體問(wèn)題處于探索階段。如對(duì)蝦青素生物合成過(guò)程中所推測(cè)的某些中間代謝物仍未完全分離和測(cè)定；對(duì)蝦青素生物合成途徑中相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的識(shí)別尚未達(dá)到足夠的分辨率，脅迫誘導(dǎo)引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、級(jí)聯(lián)傳遞途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分還沒(méi)有完全判明。

活性氧和質(zhì)體末端氧化酶參與蝦青素合成的誘導(dǎo)調(diào)控通路的直接證據(jù)目前仍然缺乏。蝦青素生物合成與光合作用之間的關(guān)系一直是研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)，但是蝦青素與光系統(tǒng)以及光合電子傳遞鏈各組分之間的相互作用，至今仍未得到完全解析。另外，對(duì)那些發(fā)生在蝦青素大量積累和其他類(lèi)胡蘿卜素合成之前的早期事件了解甚少，而且對(duì)該過(guò)程中參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子研究也相對(duì)薄弱。

針對(duì)以上問(wèn)題，近年來(lái)在微藻研究領(lǐng)域得到較好應(yīng)用的多組學(xué)meta分析和“轉(zhuǎn)錄因子工程”分析技術(shù)為克服以往的困難提供了強(qiáng)有力的武器，而高性能計(jì)算技術(shù)的發(fā)展也為詳細(xì)破解雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素代謝網(wǎng)絡(luò)帶來(lái)了希望。而另外一個(gè)值得關(guān)注的方向就是通過(guò)基因工程手段將微藻細(xì)胞內(nèi)涉及蝦青素生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因進(jìn)行克隆和人工改造，然后借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建具有高積累蝦青素能力的高等植物植株，該領(lǐng)域雖然已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但是轉(zhuǎn)基因植株的生物安全性問(wèn)題目前仍然處于爭(zhēng)議之中。