利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析渤海灣的口蝦蛄遺傳多樣性

谷德賢，王 婷，許玉甫，吳 寧，王 娜，郝 郁，王 剛，李文雯，劉國山

( 1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221； 2.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院，河北 秦皇島 066200 )

口蝦蛄(Oratosqillaoratoria)，屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、口足目、蝦蛄科、口蝦蛄屬[1]，從俄羅斯的彼得大帝灣到日本、中國沿海、菲律賓、馬來半島、夏威夷群島均有分布，我國以黃海、渤海產(chǎn)量最大[2]。作為中國沿海重要的近海漁業(yè)資源種類，隨著捕撈強(qiáng)度的增加，資源量不斷減少，因此近年來國內(nèi)外有關(guān)口蝦蛄的研究日益增多，研究內(nèi)容主要集中在口蝦蛄的基礎(chǔ)生物學(xué)[3-6]、形態(tài)學(xué)[6]、發(fā)育生物學(xué)[7-8]、資源學(xué)[9-12]等方面。口蝦蛄遺傳學(xué)方面的研究有：張代臻等[13-14]基于線粒體COⅠ基因研究了黃海、渤?？谖r蛄遺傳多樣性；隋宥珍等[15]基于線粒體Cytb基因研究了黃海、東海、南?？谖r蛄遺傳多樣性；劉海映等[16]基于RAPD研究了大連海域口蝦蛄資源遺傳多樣性的分析；張陽等[17-18]開發(fā)了部分口蝦蛄的微衛(wèi)星標(biāo)記。

微衛(wèi)星即簡單重復(fù)序列(SSR)技術(shù)是常用的分子標(biāo)記技術(shù)之一，它符合孟德爾遺傳規(guī)律，多態(tài)性高且為共顯性遺傳，是一種極具應(yīng)用價值的遺傳分子標(biāo)記。筆者采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，利用已知的微衛(wèi)星標(biāo)記對渤海灣5個自然種群的口蝦蛄進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析，旨在為渤海灣海域口蝦蛄的種質(zhì)資源保護(hù)及合理有效地開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年11月在渤海灣的秦皇島、唐山、昌黎、天津、黃驊5個海域，通過單拖網(wǎng)調(diào)查取樣，每個海域采集口蝦蛄鮮活樣本40尾，取背部肌肉組織，無水乙醇固定后保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 取樣站位經(jīng)緯度Tab.1 The latitude and longitude of sampling stations

1.2 基因組DNA提取

采用醋酸銨法提取基因組DNA，用核酸蛋白儀測量DNA質(zhì)量濃度，并根據(jù)DNA質(zhì)量濃度將DNA稀釋到100 μg/mL作為工作液。

1.3 引物合成及PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)所用的16對微衛(wèi)星引物為張陽等[17-18]已發(fā)表的微衛(wèi)星序列(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 16對微衛(wèi)星引物及其退火溫度Tab.2 Sequences and annealing temperature of sixteen pairs of microsatellite maker

PCR反應(yīng)體系為25 μL：引物F(10 μmol/L) 1 μL，引物R(10 μmol/L) 1 μL，dNTP(10 μmol/L)1 μL，Taq Buffer(10×)2.5 μL，Taq酶(5 U/μL )0.5 μL，無菌水補(bǔ)齊到25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 S，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸5～8 min。PCR 擴(kuò)增在PE9700型PCR儀上進(jìn)行。將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取10 μL加入上樣板中，再加入1 μL PCR產(chǎn)物。然后使用3730XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，使用Genemapper軟件得到擴(kuò)增片段大小。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用Popgen 32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別完成等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、群體間遺傳距離、相似指數(shù)計算以及聚類分析、哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)。采用軟件MEGA 6.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。最后根據(jù)等位基因頻率計算多態(tài)信息含量(PIC)[19]：

式中，pi和pj分別是第i和第j個等位基因數(shù)的頻率，n為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體遺傳多樣性分析

根據(jù)16對引物的PCR預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，篩選出12對引物用于遺傳多樣性分析，12個位點(diǎn)在5個群體中的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、平均多態(tài)信息含量和哈迪溫伯格平衡數(shù)據(jù)見表3。

表3 5個口蝦蛄群體在12個微衛(wèi)星位點(diǎn)的多樣性指數(shù)Tab.3 The polymorphic information at 12 microsatellite loci of five populations of mantis shrimp O. oratoria

利用12對微衛(wèi)星引物對5個群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，共檢測到等位基因375個，其中秦皇島群體77個、唐山群體70個、昌黎77個、天津群體74個、黃驊群體77個。5個群體共獲得99個不同等位基因，其中每個位點(diǎn)等位基因數(shù)3～16個，KXG01和KXG04檢測到等位基因最少(均為3個)，KXG07檢測到等位基因最多(17個)，其他位點(diǎn)檢測到等位基因數(shù)為4～13個。

各群體平均有效等位基因數(shù)為2.9063～3.4102，平均觀測雜合度為0.5004～0.5342，平均期望雜合度為0.5310～0.5491。其中除期望雜合度唐山群體最高外，其他上述指標(biāo)數(shù)值均為秦皇島群體最高。通過基因頻率計算多態(tài)信息含量，檢測的60個位點(diǎn)中，KXG01在秦皇島、唐山、昌黎、黃驊群體中及KXG03在昌黎、天津群體中為單態(tài)，5個群體平均多態(tài)信息含量為0.5422～0.6038，其中，昌黎群體的多態(tài)信息含量最高，黃驊群體的多態(tài)信息含量最低。12個位點(diǎn)中，KXG01、KXG03、KXG04為低多態(tài)性位點(diǎn)(平均多態(tài)信息含量<0.25)，KXG08為中度多態(tài)(0.25<平均多態(tài)信息含量<0.5),其他8個位點(diǎn)均為高度多態(tài)(平均多態(tài)信息含量>0.5)。哈迪溫伯格平衡檢測，49個位點(diǎn)符合哈迪溫伯格平衡(P>0.05)，11個位點(diǎn)偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.05)，偏離哈迪溫伯格平衡的現(xiàn)象在5個群體中均存在。本研究中8個位點(diǎn)(KXG02、KXG07、KXG08、KXG09、KXG10、KXG11、KXG12、KXG16)在5個群體中均符合平衡。

2.2 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

應(yīng)用Popgen 32軟件計算群體間遺傳距離和相似指數(shù)，5個群體相互之間的遺傳距離為0.0143～0.0365，遺傳相似性為0.9775～0.9858，表明黃驊群體與昌黎、秦皇島群體遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近。天津群體與唐山群體的遺傳距離最大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。聚類樹分析顯示，秦皇島種群與唐山群體聚在一起，昌黎群體與黃驊群體聚在一起，而后又與天津群體聚在一起。

表4 5個群體的遺傳距離和相似性指數(shù)Tab.4 The genetic distances and genetic identity of the five populations

圖1 5個群體的UPGMA聚類樹Fig.1 The UPGMA dendrogram of the five populations

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

依據(jù)微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)[20]，當(dāng)?shù)任换驍?shù)超過4時能較好地反映群體遺傳變異水平，本研究中5個群體中檢測的平均等位基因數(shù)為5.8333～6.4167，平均有效等位基因數(shù)為2.9063～3.4102，該數(shù)據(jù)能夠有效地用于5個群體的遺傳多樣性分析。雜合度越高，群體的遺傳多樣性豐度越高，群體對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)[21]。5個研究群體中，秦皇島群體的平均觀測雜合度與期望雜合度相對于其他4個群體較高，其對環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，具有較豐富的育種和遺傳改良潛力。

多態(tài)信息含量是衡量基因位點(diǎn)群體多態(tài)性的重要指標(biāo)之一，可以反映出群體的遺傳變異程度[22]。12個微衛(wèi)星位點(diǎn)，8個高度多態(tài)性位點(diǎn)，1個中度多態(tài)性位點(diǎn)，3個低度多態(tài)性位點(diǎn)。總體來說，位點(diǎn)多態(tài)性較高，在群體遺傳多樣性分析中，得出的可靠性較高[23]。對5個群體的多態(tài)信息含量計算表明，5個群體的多態(tài)信息含量均為高度多態(tài)性，其中昌黎群體多態(tài)信息含量最高，其次為秦皇島群體，黃驊群體最低。哈迪溫伯格平衡檢測表明，81.67%符合哈迪溫伯格平衡，偏離平衡的現(xiàn)象不明顯。其中，天津群體哈迪溫伯格平衡P值最低，可能由于天津群體處于渤海灣最西部，與其他群體雜交較少，導(dǎo)致群體中雜合子缺失。

綜合分析，渤海灣5個海域的口蝦蛄群體遺傳多樣性處于高度多態(tài)性，其中秦皇島、昌黎口蝦蛄群體相對較高，天津、黃驊口蝦蛄群體相對較低。

3.2 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳距離越遠(yuǎn)，分化時間越長，雜種優(yōu)勢越大，即遺傳距離與分化關(guān)系呈正相關(guān)。Shaklee等[24]研究認(rèn)為，0.05≤遺傳距離<0.3為同種不同群體；0.3≤遺傳距離<0.9為同屬不同種群體；遺傳距離≥0.9為不同屬群體。本試驗(yàn)5個群體間遺傳距離均小于0.05，認(rèn)為5個群體為同種群，未發(fā)生明顯遺傳分化。張代臻等[13]基于線粒體COⅠ基因?qū)|營、葫蘆島、天津海域口蝦蛄的遺傳分化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3個不同海域沒有明顯的分化。由此可見，渤海灣各海域的口蝦蛄可能起源于一個祖先種群，而后不斷形成不同的種群。

遺傳距離和聚類樹分析表明，天津群體與其他4個群體關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能是因?yàn)樘旖虻靥幉澈车淖钗鱾?cè)，與其他海域口蝦蛄交流較少。其他4個群體中，秦皇島、唐山群體聚在一起，昌黎、黃驊群體聚在一起。這些海域的口蝦蛄種群沒有以海域?yàn)閱挝桓髯跃奂?，而是交錯聚集，說明渤海灣內(nèi)口蝦蛄的種群遺傳分化不顯著。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，渤海灣5個海域的口蝦蛄群體遺傳多樣性處于高度多態(tài)性，同時符合哈迪溫伯格平衡的程度較高，5個海域的口蝦蛄遺傳分化程度較低。秦皇島群體的雜合度、多態(tài)信息含量較高，天津群體與其他4個群體關(guān)系較遠(yuǎn)。建議加強(qiáng)口蝦蛄群體的保護(hù)工作，防止過度捕撈，避免出現(xiàn)種質(zhì)遺傳資源的衰退，并適度開展人工繁育。在進(jìn)行人工繁殖研究時選取遺傳距離較遠(yuǎn)的個體作為親本，同時對同一繁殖群體可進(jìn)行不同地理區(qū)域放流，以增加群體遺傳多樣性，保證種質(zhì)資源永續(xù)利用。