水生動物C1qDC蛋白研究進展

高園園，朱 雷，孔祥會

( 河南師范大學 水產學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

C1q是構成補體系統(tǒng)C1的重要成分，具有與配體結合的“球形”蛋白結構域，在結構上與腫瘤壞死因子十分類似。當C1q與免疫球蛋白IgM或IgG的Fc段結合后，C1q結構發(fā)生變化，進而導致C1r和C1s的相繼活化，并啟動補體經典激活途徑[1-2]。C1q還具有清除凋亡細胞、識別病原和調節(jié)細胞生長等功能[3-6]。研究人員發(fā)現，許多非補體蛋白分子C末端也含有C1q“球形”結構域，并將這些蛋白統(tǒng)稱為C1q結構域蛋白(C1qDC蛋白)[7-8]，這些數量龐大的蛋白分子共同組成了一個嶄新的蛋白家族——C1qDC蛋白家族。通過分析C1qDC蛋白在不同種類物種中的分布特點，研究人員認為C1qDC基因起始于原口類動物，并逐漸輻射至脊椎動物[9]。隨著現代分子生物學技術的不斷進步和發(fā)展，越來越多的C1qDC蛋白分子在水生無脊椎和低等脊椎動物中被發(fā)現和鑒定。研究發(fā)現，水生動物C1qDC蛋白在識別病原、抵御病原入侵等先天性免疫活動中發(fā)揮重要作用。因此，筆者綜述了水生動物C1qDC蛋白近年來的最新研究進展，以期為水生動物C1qDC蛋白的相關研究提供理論依據。

1 C1qDC蛋白在水生動物中的鑒定及分布特點

C1qDC蛋白在貝類中廣泛分布。通過全基因組和轉錄組序列數據庫分析和挖掘，研究人員在長牡蠣(Crassostreagigas)中鑒定到337個具有完整編碼區(qū)的C1qDC基因序列，這些C1qDC基因通常是成簇出現，且CDS區(qū)域較為完整，這一現象被認為和基因擴張有關。長牡蠣C1qDC基因組織表達具有顯著特異性，在鰓和消化腺中的表達水平最高[10]。Zhang等[11-12]對生長在河口環(huán)境下的長牡蠣基因組數據的研究顯示，C1qDC基因在長牡蠣消化腺中高豐度表達，并推測高豐度表達的C1qDC基因與抵御外界病原體感染有關。C1qDC基因的擴張現象在地中海紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)中亦有發(fā)現，地中海紫貽貝中的168個C1qDC基因序列在血細胞、消化腺和鰓中表達水平較高[13]?；诤成蓉?Argopectenirradians)EST數據庫，Kong等[14]使用RACE技術鑒定到C1qDC基因全長序列，并發(fā)現其在肝胰腺中的表達豐度最高。Zhao等[15]利用RACE技術在三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)中克隆鑒定到4個C1qDC基因全長序列，發(fā)現其在血細胞、肝胰腺、鰓、外套膜等免疫相關組織中廣泛分布。Zhang等[16]自菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)血細胞cDNA文庫中克隆鑒定到4個C1qDC基因全長序列。鄭哲[17]在馬氏珠母貝(Pinctadafucatamartensii)中克隆鑒定到4個C1qDC基因，發(fā)現其在外套膜中表達量較高。

隨著研究的深入，C1qDC基因在魚類中也被陸續(xù)鑒定和發(fā)現。劉閣等[18]在七鰓鰻(Lethenteroncamtschaticum)肝臟cDNA文庫中克隆獲得19個結構各異的C1qDC基因序列，并將其分成了3個亞家族，為進一步深入研究C1qDC基因的結構和功能奠定了基礎。通過對斑馬魚(Daniorerio)EST、cDNA和基因組數據庫的綜合檢索，Mei等[19]共篩選出52個獨立的C1qDC基因序列，并且該類基因編碼的氨基酸序列結構呈現顯著多樣性?；贓ST數據庫，研究人員也從半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)基因組中克隆鑒定到C1qDC基因，并對其編碼的蛋白功能進行了一系列研究[20]。Nakamura等[21]在蘭氏褐海鯽(Neoditremaransonnetii)血漿中分離鑒定到一種與巖藻糖結合的C1qDC蛋白，并且該C1qDC蛋白序列具有一些保守結構位點。

目前，C1qDC基因已經在多種水生動物中得到鑒定，主要包括長牡蠣[10,22-24]、地中海紫貽貝[13,25]、海灣扇貝[14,26]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[27]、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)[15]、七鰓鰻[28]、許氏平鲉(Sebastesschlegelii)[29]、文昌魚(Branchiostomafloridae)[30]、斑馬魚[31]、半滑舌鰨[20]和蘭氏褐海鯽[21]等。C1qDC基因在水生無脊椎和脊椎動物中廣泛存在，并在雙殼類生物長牡蠣和地中海紫貽貝中發(fā)生較大規(guī)模的基因擴張，其數量遠多于魚類和人類中的C1qDC基因的數量，出現這一現象的原因可能與無脊椎動物缺乏獲得性免疫、抵御外界不良環(huán)境和病原的能力較弱有關。

2 C1qDC基因擴張?zhí)攸c

2011年，Gerdol等[13]對地中海紫貽貝進行Sanger測序后，發(fā)現并鑒定到168個不同的C1qDC基因序列，隨著新一代測序技術的出現，地中海紫貽貝中C1qDC基因數量增加至232個[32]。2015年，Gerdol等[10]通過深入挖掘牡蠣基因組數據，發(fā)現雙殼類動物長牡蠣中C1qDC基因發(fā)生了基因擴張。隨著研究的不斷深入，研究人員發(fā)現C1qDC基因家族的擴張不局限于地中海紫貽貝中，在長牡蠣和美洲牡蠣(C.virginica)中也均有發(fā)生[10,33]。基于此，研究人員推測雙殼類中C1qDC基因發(fā)生了大規(guī)模的基因擴張事件。

通過對地中海紫貽貝和牡蠣等基因組和轉錄組數據的研究，發(fā)現C1qDC基因在擴張過程中存在以下特點：(1)C1qDC基因序列豐度高、多樣性高，C1qDC蛋白結構域呈現高變異性；(2)C1qDC基因在擴張過程中存在碎片化，如馬氏珠母貝有234個C1qDC預測基因序列，但是生物信息學軟件HMMER分析顯示，在其基因組中有多達720個C1qDC基因位點[34]；(3)與其他軟體類動物相比(腹足類和頭足類物種)，雙殼類動物的C1qDC轉錄本數目眾多，這表明C1qDC基因家族的擴張可能僅限于雙殼類動物。進一步研究發(fā)現，C1qDC基因的大規(guī)模擴張只發(fā)生在雙殼綱的畸形亞綱和異齒亞綱中，而原鰓亞綱和古異齒亞綱中幾乎不存在[10,13]。

3 水生動物C1qDC蛋白的結構及保守性

水生動物中C1qDC蛋白分子結構與人類補體C1復合物的C1qA、B和C肽鏈結構類似但也存在一些不同之處(表1)。根據C1qDC蛋白分子的結構域構成特點[9]，發(fā)現水生動物C1qDC蛋白主要以C1q-like和球形頭狀C1q (ghC1q)兩種類型存在。

表1 補體C1q分子與C1qDC蛋白結構與功能比較Tab.1 Comparison of structure and function between complement C1q and C1qDC protein

C1q-like蛋白羧基端編碼一個“球形”C1q結構域[9]，氨基端存在Gly-Pro-X(其中X可以是任何其他氨基酸)的氨基酸重復序列，可形成膠原樣區(qū)。與C1q-like蛋白不同的是，ghC1q蛋白氨基端缺乏膠原樣區(qū)，沒有特定的基序。根據氨基末端是否編碼信號肽序列，ghC1q蛋白又可分為頭狀分泌型C1q蛋白(sghC1q)和頭狀胞內型C1q蛋白(cghC1q)。sghC1q型蛋白氨基末端編碼一段信號肽序列，所編碼的蛋白具有胞外分泌能力，cghC1q型蛋白不含信號肽序列，不具有分泌到胞外的能力[9]。據此可知，C1qDC蛋白家族成員呈現出多樣化的特點，這一結果與關鍵氨基酸的變化、膠原樣區(qū)的有無以及與其他結構域的組成有關。

進一步分析水生動物C1qDC蛋白的“球形”C1q結構域發(fā)現其具有明顯的保守性和高度的序列變異性[13]。對斑馬魚所有C1qDC序列進行多序列比對發(fā)現，這些蛋白序列雖然某些位置的氨基酸位點出現較大變異，但其C1q結構域的β折疊處氨基酸位點具有明顯的保守性[19]。長牡蠣的多個C1qDC蛋白在C1q結構域處的氨基酸序列僅有1/4呈現出一定保守性，其余區(qū)域顯示出高度變異性[10]。同樣，地中海紫貽貝中C1qDC蛋白序列C1q結構域也呈現高度的序列變異性，僅有少量氨基酸殘基顯示保守性[13]?；诋斍暗难芯拷Y果，筆者將已經報道的水生動物和人類的C1qDC蛋白序列的數目與結構域構成特點進行了歸納總結(表2)，可以發(fā)現C1qDC蛋白在不同物種中數目差異較大，結構域構成呈現多樣化。

表2 不同物種C1qDC蛋白序列數目與結構特征Tab.2 Number and structural characteristics of C1qDC protein sequences in different species

4 水生動物C1qDC蛋白分類

4.1 貝類C1qDC蛋白分類

貝類C1qDC蛋白存在C1q-like和ghC1q 兩種類型。Gerdol等[10]研究了C1qDC蛋白結構域組成，發(fā)現長牡蠣C1qDC蛋白主要存在C1q-like和ghC1q類型，但也發(fā)現C1q-like和ghC1q蛋白結構域組成具有多樣性，有些具有膠原樣區(qū)和C1q結構域，有些具有與膠原樣區(qū)功能類似的卷曲螺旋結構和C1q結構域，有些具有信號肽和C1q結構域，有些僅具有C1q結構域，有些具有SUEL凝集素結構和C1q結構域。SUEL凝集素結構可與D-半乳糖苷/L-鼠李糖結合[35]。Gerdol等[13]根據相同的分類方法對地中海紫貽貝168個C1qDC蛋白序列進行分類，發(fā)現地中海紫貽貝中僅1個C1qDC蛋白序列以C1q-like類型存在；其他均以ghC1q類型蛋白存在。另外，在三角帆蚌[38]、櫛孔扇貝[27]等貝類中，C1qDC蛋白均以ghC1q類型存在。

4.2 魚類C1qDC蛋白分類

魚類中C1qDC蛋白也有C1q-like和ghC1q兩種類型。Mei等[19]在斑馬魚基因組數據庫中鑒定到52條C1qDC蛋白序列，根據其N端是否含有膠原樣區(qū)和信號肽結構，將斑馬魚C1qDC蛋白主要分為：(1)僅具有C1q結構域以及具有信號肽和C1q結構域的ghC1q類型蛋白；(2)具有膠原樣區(qū)和C1q結構域以及具有信號肽、膠原樣區(qū)和C1q結構域的C1q-like類型蛋白。劉閣等[18]根據七鰓鰻C1qDC蛋白結構域構成特點將其分為：(1)具有信號肽、膠原樣區(qū)和C1q結構域以及具有膠原樣區(qū)和C1q結構域的C1q-like類型蛋白；(2)僅具有C1q結構域的ghC1q類型蛋白。Huang等[30]在文昌魚中獲得50個C1qDC蛋白序列，其中42個蛋白為C1q-like類型，由膠原樣區(qū)和C1q結構域組成。另外，在半滑舌鰨[20]、許氏平鲉[29]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[39]、蘭氏褐海鯽[21]等魚類中，C1qDC蛋白均以ghC1q類型存在。

4.3 其他水生動物C1qDC蛋白分類

C1qDC蛋白不僅在多種魚類和貝類中被廣泛研究，而且在海膽、海鞘和水蛭(Hirudomedicinalis)等其他水生動物中也被研究和分類。研究發(fā)現，紫色球海膽中有7個C1qDC蛋白序列，且均以C1q-like類型存在[36]，玻璃海鞘中發(fā)現的2個C1qDC蛋白序列也均為C1q-like類型蛋白[37]。此外，Tahtouh等[40]發(fā)現，水蛭中C1qDC蛋白同樣以C1q-like類型存在。

5 水生動物C1qDC蛋白的功能特性

5.1 C1q-like類型蛋白功能特性

C1q-like蛋白的免疫功能已在多種水生動物中得到研究。牡蠣C1q-like蛋白不僅具有抗菌活性，且可作為調理素增強牡蠣血細胞的吞噬作用，還能夠介導牡蠣血細胞的遷移[41]。水蛭C1q-like蛋白具有趨化活性，可參與早期受損小神經間質細胞的恢復，在水蛭中樞神經修復過程中起著重要作用[40]。脊索動物海鞘中所發(fā)現的C1q-like蛋白具有類似補體C1q分子的作用，推測其可以特異性識別和結合病原微生物表面的寡聚糖結構[37]。文昌魚中C1q-like蛋白可通過與脂多糖相互作用來抑制血小板聚集反應的發(fā)生[42]。七鰓鰻中分離出的C1q-like蛋白能夠和N-乙酰葡糖胺相結合，并且可以與絲氨酸蛋白酶-A形成復合體進而裂解七鰓鰻體內的補體C3蛋白[43]，推測其可能執(zhí)行類似于凝集素的功能，參與補體凝集素途徑。斑馬魚中C1q-like蛋白能夠特異性結合斑馬魚免疫球蛋白IgM及人免疫球蛋白IgG和IgM，還能抑制經典途徑引起的溶血反應[44]，該結果也表明硬骨魚中可能存在補體經典途徑，而C1q-like蛋白在其中發(fā)揮啟動補體經典途徑的作用。通過以上研究可以看出，C1q-like蛋白可以識別細菌、增強細胞吞噬作用以及參與補體途徑，以此在水生動物先天性免疫中發(fā)揮重要作用。

C1q-like蛋白不僅具有重要免疫功能，還有一些其他功能。Gerdol等[10]認為長牡蠣中具有卷曲螺旋結構域的C1q-like蛋白序列，可作為膠原樣區(qū)結構域的一種替代，協助C1qDC蛋白形成多聚體，由此可見，該蛋白具有組織和穩(wěn)定多組分C1qDC蛋白復合物的作用[45]。除此之外，C1q-like蛋白還在幼體發(fā)育過程中發(fā)揮重要調控作用。長牡蠣中C1q39基因在幼體發(fā)育的原腸胚到鼓膜幼蟲階段表達水平極高，而在成年組織中表達水平極低[10]，說明C1q39蛋白在長牡蠣幼體發(fā)育過程中至關重要。

5.2 ghC1q類型蛋白功能特性

ghC1q蛋白分為sghC1q和cghC1q兩類。sghC1q蛋白在雙殼貝類和魚類中廣泛分布，并且在機體先天性免疫過程中發(fā)揮重要功能。三角帆蚌中sghC1q基因不僅參與了抗細菌免疫響應過程，而且敲除該基因后會導致免疫基因(TNF和WAP)表達水平降低，表明sghC1q蛋白在免疫信號通路中發(fā)揮關鍵作用[15,38]。海灣扇貝中鑒定到的sghC1q蛋白，對細菌和真菌具有明顯的凝集活性，可發(fā)揮類似凝集素的功能[14]。研究人員推測在免疫球蛋白進化之前，C1qDC蛋白可以通過凝集素途徑激活古老的補體系統(tǒng)[26]。在長牡蠣[46]、櫛孔扇貝[27]及地中海紫貽貝[13]中，sghC1q蛋白可與多種細菌或病原類似物結合，執(zhí)行模式識別受體功能。在魚類中，sghC1q蛋白同樣具有模式識別受體功能和凝集素活性。在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[47]、斑馬魚[31]和半滑舌鰨[20]中鑒定到的sghC1q基因可參與細菌刺激魚體后的免疫響應過程。在蘭氏褐海鯽血漿中分離得到的sghC1q蛋白可發(fā)揮凝集素活性，且在非還原條件下sghC1q蛋白可以形成多聚體[21]。許氏平鲉[29]中的sghC1q蛋白可作為模式識別受體，發(fā)揮結合LPS和PGN的作用，還可結合免疫球蛋白參與補體經典途徑，以及作為調理素增強巨噬細胞對副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的吞噬活性。sghC1q蛋白不僅具有重要的免疫功能，而且參與機體幼體發(fā)育過程。斑馬魚受精后0～48 h，sghC1q基因表達水平受到嚴格調控并呈現出不同的表達模式。其中sghC1q01和sghC1q04以及sghC1q14基因在受精后約24 h開始轉錄，這一時期是咽部形成過渡期，說明其與咽部發(fā)育相關[31]。

cghC1q蛋白主要存在于環(huán)節(jié)動物之前的物種中，最早可追溯到芽孢桿菌屬(Bacillus)細菌[18]。存在于低等生物中的cghC1q蛋白與哺乳動物的細胞周期相關蛋白高度相似，細胞周期相關蛋白能參與細胞增殖等細胞內的許多反應[48]。目前水生動物中關于cghC1q蛋白的報道較少，僅在長牡蠣[49]中鑒定得到cghC1q類型蛋白。該蛋白不僅可作為模式識別受體結合細菌，也可作為調理素來促進長牡蠣血細胞的吞噬作用[49]，進而增強長牡蠣血細胞對大腸桿菌(Escherichiacoli)和燦爛弧菌(V.splendidus)的吞噬能力[50]。

根據已報道的水生生物中C1q-like和ghC1q蛋白的研究結果，可以發(fā)現兩種類型的C1qDC蛋白均具有識別結合病原、促進細胞吞噬作用以及可能參與補體激活途徑等免疫功能，并且在水生動物幼體發(fā)育過程中發(fā)揮重要調控作用。

6 總結與展望

補體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其組成成分在先天性免疫反應中發(fā)揮至關重要的作用[51-56]。C1qDC蛋白作為水生動物補體系統(tǒng)的重要成分，數目繁多，功能多樣[57-60]。C1qDC蛋白不但參與水生動物抵御外界病原入侵的過程，而且具有模式識別和調節(jié)補體的功能。隨著測序技術不斷提高，越來越多的水生動物C1qDC蛋白序列被鑒定出來，為該蛋白家族成員的研究工作提供了豐富的數據支撐；既擴展了對該家族蛋白成員的認識，又為深入探索C1qDC蛋白家族蛋白成員的功能和補體系統(tǒng)激活等相關研究提供重要的理論依據。

目前，關于水生低等脊椎動物和無脊椎動物C1qDC蛋白的研究還處于初級階段，尚有許多科學問題值得進一步探索，主要體現于：(1)C1qDC蛋白家族序列在從低等脊椎動物到哺乳類中廣泛存在，但是對于該基因的起源和系統(tǒng)進化關系尚待深入研究；(2)水生動物C1qDC蛋白能與病原或免疫球蛋白結合，這種相互作用已被映射到“球形”C1q結構域的不同結合位點[61]，然而，尚未發(fā)現促進這種相互作用的特定氨基酸基序；(3)C1qDC蛋白家族成員的功能及其調控的分子機制仍需深入研究。查明C1qDC蛋白家族成員的起源、功能及其調控的分子機制，對于提高水生動物免疫能力和疾病防控水平具有重要理論意義。