CAR-T療法在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展*

彭宇，姚定康

200003 上海，海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院 消化內(nèi)科

嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)免疫療法是一種改良的T細(xì)胞免疫治療術(shù)，是將抗體對(duì)抗原的高特異性與T細(xì)胞對(duì)靶腫瘤的細(xì)胞毒性相結(jié)合的一種方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的基本結(jié)構(gòu)為胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域[1]，胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域是識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原的單鏈可變區(qū)(single-chain variable fragment，scFv)，scFv通過鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相連，當(dāng)T細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原后，scFv段與腫瘤抗原結(jié)合可直接激活并啟動(dòng)T細(xì)胞殺傷機(jī)制。這種CAR結(jié)構(gòu)使T細(xì)胞越過主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)提呈機(jī)制直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞，避免了由于MHC分子的限制和MHC分子表達(dá)下調(diào)引起的腫瘤免疫逃逸問題[2]；且MHC只能提呈蛋白質(zhì)片段，而CAR得益于其抗原抗體機(jī)制還可識(shí)別細(xì)胞表面的多糖以及脂類蛋白；CAR-T細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)識(shí)別腫瘤并激活后可穩(wěn)定增殖以形成持續(xù)殺傷力，并通過釋放細(xì)胞因子等方式召集其他免疫細(xì)胞協(xié)同作戰(zhàn)。這些性質(zhì)使得CAR-T療法與單抗以及小分子靶向藥物等血藥濃度會(huì)隨時(shí)間下降的治療方式相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本文將對(duì)CAR-T的發(fā)展以及在消化系統(tǒng)腫瘤中的進(jìn)展做一個(gè)較為詳盡的介紹，旨在為CAR-T未來的發(fā)展方向及在消化系統(tǒng)腫瘤的臨床應(yīng)用提供參考。

1 CAR-T療法的發(fā)展

CAR-T療法目前已發(fā)展至第四代，第一代CAR僅有scFv和一個(gè)CD3ζ胞內(nèi)信號(hào)域，由于缺少必要的共刺激信號(hào)，在體內(nèi)擴(kuò)增能力有限;第二代增加了一個(gè)共刺激信號(hào)CD28或4-1BB;第三代則包含兩個(gè)共刺激信號(hào)，一個(gè)是CD28或4-1BB，另一個(gè)為OX40、DAP-10或ICOS，使得 CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)持久穩(wěn)定擴(kuò)增并且分泌細(xì)胞因子增加從而有效殺傷癌細(xì)胞;第四代CAR-T細(xì)胞又被稱為TRUCK T細(xì)胞(T-cells redirected for universal cytokine killing )，新加入的細(xì)胞因子序列使CAR-T細(xì)胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細(xì)胞因子，增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)，開啟了CAR-T療法應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的新思路。

2 CAR-T療法在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究

2.1 肝癌

迄今為止，CAR-T療法在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)治療的臨床前研究成果頗豐，磷脂酰肌醇聚糖3(glypican-3,GPC3)是研究的熱門靶點(diǎn)，α甲胎蛋白、粘蛋白1(mucin 1,MUC1)、上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecules,EpCAM)和癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)等亦是HCC患者CAR-T治療的良好靶標(biāo)[3]。GPC3在HCC中高表達(dá)但在正常組織中表達(dá)受限，靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞可有效消滅GPC3陽(yáng)性的HCC細(xì)胞，為GPC3陽(yáng)性的HCC提供了治療策略，目前已有靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞用于治療HCC的十幾個(gè)臨床試驗(yàn)[4- 5]。含有hYP7受體的CAR-T細(xì)胞對(duì)GPC3的C端具有高親和力，CAR(hYP7)T細(xì)胞可能通過誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡，或下調(diào)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以清除GPC3+HCC細(xì)胞，研究結(jié)果顯示被注射CAR(hYP7)T細(xì)胞的小鼠中，有66%的小鼠體內(nèi)的HCC被消滅[6]。為減少單靶點(diǎn)CAR-T伴隨的脫靶效應(yīng)，Chen等[7]開發(fā)了靶向GPC3和唾液酸糖蛋白受體1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)的CAR-T，這種雙重CAR-T可殺死同時(shí)表達(dá)GPC3和ASGR1抗原的HCC細(xì)胞，但不影響單獨(dú)表達(dá)兩種抗原的正常組織細(xì)胞，特異性、安全性和抗腫瘤作用更強(qiáng)。

程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)及程序性死亡受體-配體1 (programmed cell death-ligand 1,PD-L1)介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制與包括HCC在內(nèi)的多種實(shí)體瘤的免疫逃逸有關(guān)，抑制GPC3 CAR-T的PD-1表達(dá)可以增強(qiáng)CAR-T對(duì)HCC細(xì)胞的殺傷作用[8]。與對(duì)照組GPC3 CAR-T細(xì)胞相比，阻斷了PD-1 / PD-L1通路的GPC3 CAR-T細(xì)胞特異性識(shí)別并裂解GPC3+HCC細(xì)胞的能力更強(qiáng)，且治療后的HCC異種移植小鼠血液循環(huán)和腫瘤組織中CD3+T細(xì)胞水平更高，而顆粒酶B和Ki67表達(dá)水平更低[9]。因此，構(gòu)建一種同時(shí)阻斷腫瘤免疫逃逸通路的新型GPC3 CAR-T細(xì)胞可能是治療HCC的新型策略。

CAR-T細(xì)胞能夠在腫瘤區(qū)域分泌特定的細(xì)胞因子，目前主要是白介素12(interleukin 12,IL-12)，在肝癌小鼠模型中誘導(dǎo)表達(dá)IL-12可以增強(qiáng)GPC3 CAR-T功能，并減少細(xì)胞因子過量釋放的副作用[10]。另外，用CAR-T聯(lián)合化療亦可有效降低治療副作用，低劑量的索拉非尼即可增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在肝癌小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的IL-12分泌和癌細(xì)胞凋亡，表明索拉非尼與GPC3 CAR-T聯(lián)合治療HCC具有臨床應(yīng)用潛力[11]。異曲同工的是，Zhang等[12]開發(fā)了一種靶向CD147的新型誘導(dǎo)型CAR-T，通過在HCC局部注射強(qiáng)力霉素，可增加CAR-T細(xì)胞在腫瘤組織中的駐留率并可減少全身吸收，且強(qiáng)力霉素的存在促進(jìn)了CD147 CAR-T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌，這或許是一種可行的CAR-T聯(lián)合治療策略。但CD147是腫瘤相關(guān)抗原，因此CD147 CAR-T細(xì)胞仍然可能識(shí)別并攻擊表達(dá)CD147的正常組織，這也是其不足之處。

2.2 胰腺癌

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺最常見的惡性腫瘤，間皮素(mesothelin,MSLN)、CEA、HER2、MUC-1、NK-R、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSCA)、CD133和CD24是CAR-T治療PDAC的常見靶標(biāo)[13]。MSLN是一種細(xì)胞表面糖蛋白，其過表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，MSLN高表達(dá)的癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1上調(diào)，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。與對(duì)照組CAR-T細(xì)胞相比，靶向MSLN的CAR-T(CART-meso)顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，IFN-γ分泌水平更高，且在腫瘤緩解后更多的CART-meso細(xì)胞分化為記憶T細(xì)胞，并對(duì)胰腺癌異種移植小鼠的主要器官造成的損害最小[15]。I期臨床試驗(yàn)已證明CART-meso細(xì)胞治療的PDAC患者未出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，且六分之二的患者病情穩(wěn)定[16]。

盡管目前CAR-T療法在胰腺癌治療的探索已初見成效，但是臨床試驗(yàn)的副反應(yīng)卻不容忽視。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中CEA特異性CAR-T細(xì)胞治療不僅效果短暫，還會(huì)誘導(dǎo)急性呼吸道毒性，細(xì)胞因子過量釋放使得IL-6水平顯著升高[17]。而當(dāng)非腫瘤組織毒性受到控制，有效性又成了桎梏，一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)使用HER2特異性CAR-T細(xì)胞治療兩名胰腺癌患者，盡管該實(shí)驗(yàn)的安全性得到了證實(shí)，但其腫瘤殺傷效應(yīng)一般[18]。為了兼顧靶向性和安全性，研究人員設(shè)計(jì)了一種帶有抗體開關(guān)的HER2 CAR-T，它與常規(guī)HER2 CAR-T一樣有效，這種“開關(guān)”是由腫瘤抗原特異性重組fab段劑量控制的，以調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞活性的轉(zhuǎn)換，因此帶有開關(guān)的CAR-T可有效抵抗晚期PDAC患者腫瘤擴(kuò)散，同時(shí)兼具開關(guān)控制的相對(duì)安全性[19]。

不容樂觀的是，胰腺腫瘤常常采用免疫逃逸策略，比如產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子，從而限制CAR-T細(xì)胞的增殖與存活能力。為此，研究人員利用腫瘤來源的IL-4[20]、IL-8[21]、TGFβ[22]、IL-10[23]等，開發(fā)了阻斷并逆轉(zhuǎn)腫瘤來源的細(xì)胞因子抑制作用的CAR-T，使得CAR-T療法成為能夠克服腫瘤微環(huán)境免疫抑制以助于治療PDAC的潛在方法。

2.3 結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)

目前CRC的常用臨床試驗(yàn)靶點(diǎn)有CD133、CEA、EGFR、EpCAM及HER2，并分別取得了不錯(cuò)的成效?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，CD133是復(fù)發(fā)或難治性惡性腫瘤的潛在治療靶標(biāo)，一項(xiàng)招募了23例患者(14例HCC，7例胰腺癌和2例CRC)的I期臨床試驗(yàn)(NCT02541370)證實(shí)了CD133 CAR-T治療CD133陽(yáng)性晚期轉(zhuǎn)移瘤的可行性、有效性和毒力可控性[24]。一項(xiàng)I期遞增劑量試驗(yàn)(NCT02349724)納入了10例CEA陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性CRC患者，對(duì)其進(jìn)行CEA CAR-T細(xì)胞療法，結(jié)果顯示即使是給予大劑量CEA CAR-T細(xì)胞治療，患者依然耐受良好并且明顯獲益，外周血中CAR-T細(xì)胞持續(xù)增殖，多數(shù)患者的血清CEA水平也明顯下降[25]。 CAR-T細(xì)胞通過靶向EpCAM可誘導(dǎo)對(duì)EpCAM+癌細(xì)胞的溶解性細(xì)胞毒性，并分泌包括INF-γ和TNF-α在內(nèi)的細(xì)胞因子，在CRC異種移植模型中，EpCAM CAR-T治療顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)[26]。一項(xiàng)研究通過觀察HER2特異性CAR-T細(xì)胞對(duì)異種移植腫瘤的治療效果，發(fā)現(xiàn)HER2 CAR-T細(xì)胞具有滲入腫瘤組織并選擇性清除HER2+CRC細(xì)胞的能力[27]

近三年來，CAR-T在CRC的治療領(lǐng)域涌現(xiàn)出一批新的靶點(diǎn)。靶向鳥苷酰環(huán)化酶C(guanylyl cyclase C,GUCY2C)的CAR-T細(xì)胞可識(shí)別并殺死表達(dá)GUCY2C的人源性CRC細(xì)胞，在免疫缺陷的CRC異種移植小鼠模型中CAR-T細(xì)胞可持久存在，并表明人GUCY2C特異性CAR-T療法可用于治療GUCY2C陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性CRC[28]，另有研究也表明GUCY2C CAR-T細(xì)胞可以在免疫缺陷的小鼠模型中治療轉(zhuǎn)移性CRC[29]。一項(xiàng)I期試驗(yàn)用靶向腫瘤相關(guān)糖蛋白72的CAR-T(CAR-T72)對(duì)轉(zhuǎn)移性CRC進(jìn)行了治療，發(fā)現(xiàn)患者血清中腫瘤相關(guān)糖蛋白72急劇下降，但CEA并未急劇下降，證明了CAR-T72細(xì)胞的相對(duì)安全性[30]。雙皮質(zhì)素樣激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)可在CRC遺傳的小鼠模型中標(biāo)記腫瘤干細(xì)胞，靶向DCLK1的CAR-T目的在于根除CRC腫瘤干細(xì)胞，與對(duì)照組CAR-T相比，這種新型的DCLK1 CAR-T細(xì)胞毒性更強(qiáng)，CRC細(xì)胞中IFN-γ釋放水平更高，腫瘤生長(zhǎng)同比降低了約50%，證明DCLK1 CAR-T可以在體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，并在體內(nèi)抑制異種移植物的生長(zhǎng)[31]。以上結(jié)果都表明，CAR-T細(xì)胞可在CRC 中發(fā)揮治療作用，并在實(shí)體瘤的治療中顯示出巨大的潛力。

2.4 胃癌(gastric cancer，GC)

在過去的幾年中，應(yīng)用CAR-T治療GC的臨床試驗(yàn)靶點(diǎn)有MSLN、 EpCAM、CEA、MUC1、HER2和PSCA等。MSLN中的表位選擇至關(guān)重要，Zhang等[32]構(gòu)建了分別靶向MSLN的I區(qū)和III區(qū)的meso1 CAR-T與meso3 CAR-T，與meso1 CAR-T相比，meso3 CAR-T的CD107α、IL-2和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平更高，在GC小鼠模型中，meso3 CAR-T介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)更強(qiáng)。靶向MSLN的CAR-T細(xì)胞在體外對(duì)GC細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌能力，并顯著抑制GC皮下移植瘤模型中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[33]。靶向PSCA的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出與T細(xì)胞毒性相關(guān)的細(xì)胞因子增加，向體內(nèi)的GC組織周圍注射抗PSCA CAR-T細(xì)胞成功阻止了腫瘤進(jìn)展，證實(shí)了抗PSCA CAR-T細(xì)胞的可行性及其抗GC的功效，提示PSCA CAR-T細(xì)胞用于治療GC患者的臨床應(yīng)用潛力[34]。

NKG2D是NK細(xì)胞的強(qiáng)激活受體，也是T細(xì)胞的共刺激受體，靶向NKG2D的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)可顯著抑制GC異種移植物的生長(zhǎng)，此外，順鉑可上調(diào)GC細(xì)胞中NKG2D配體的表達(dá)并增強(qiáng)NKG2D CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[35]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，靶向NKG2D配體的CAR-T細(xì)胞可裂解GC細(xì)胞系和腹水來源的人原代GC細(xì)胞，表明NKG2D配體特異性CAR-T細(xì)胞是治療伴有腹膜轉(zhuǎn)移的GC患者的潛在療法[36]。

GC患者中有一些特異性表達(dá)的蛋白可以作為CAR-T設(shè)計(jì)的潛在靶標(biāo)。胃特異性緊密連接蛋白18.2(Claudin18.2,CLDN18.2)屬于緊密連接蛋白家族中的一種亞型，在所有GC患者中的陽(yáng)性率近60%，即使是在GC轉(zhuǎn)移病灶中同樣有較高的表達(dá)水平，且研究觀察到CLDN18.2特異性CAR-T細(xì)胞在CLDN18.2+GC異種移植模型中介導(dǎo)了腫瘤消退[37]。此外，超過1/3的GC患者葉酸受體1(folate receptor 1,FOLR1)在癌細(xì)胞表面過表達(dá)，但在正常組織中很少表達(dá)，現(xiàn)有研究也證明了FOLR1特異性CAR-T細(xì)胞可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子分泌促使FOLR1陽(yáng)性的GC細(xì)胞死亡[38]。因此，這些在GC組織中高表達(dá)但在正常組織中低表達(dá)的特異性蛋白，或在CAR-T領(lǐng)域具有出色的GC治療潛力。

2.5 其他消化系統(tǒng)腫瘤

目前膽管癌CAR-T治療的靶點(diǎn)有CD133、EGFR和HER2。使用CAR-T雞尾酒免疫療法治療晚期膽管癌患者，通過EGFR特異性CAR-T治療獲得了8.5個(gè)月的部分緩解，CD133 CAR-T治療獲得了持續(xù)4.5個(gè)月的部分緩解，但都伴隨一些CAR-T相關(guān)副反應(yīng)[39]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)(NCT01869166)評(píng)估了EGFR-CAR T細(xì)胞療法在EGFR+晚期膽道癌的療效，在17位患者中，1位獲得了完全緩解，10位病情穩(wěn)定[40]。另一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)(NCT01935843)評(píng)估了HER2特異性CAR-T免疫療法在晚期膽道癌和胰腺癌患者中的安全性和可行性，11名患者中，1例有4.5個(gè)月的部分反應(yīng)，5例病情穩(wěn)定[41]。

目前已有以EpCAM(NCT03013712)和HER2(NCT00889954)為靶點(diǎn)進(jìn)行CAR-T治療食管癌的臨床試驗(yàn)。肝配蛋白A型受體2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)是受體酪氨酸蛋白激酶家族中的一員，EphA2的表達(dá)在食管癌組織和細(xì)胞中顯著上調(diào)，EphA2 CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)食管癌細(xì)胞的劑量依賴性殺傷作用，并促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，為免疫療法治療食管癌開辟了一條新途徑[42]?？傮w看來，CAR-T免疫療法在一些發(fā)病率較低的消化系統(tǒng)腫瘤中的治療卓有成效，但寥落晨星，要應(yīng)用到臨床尚且任重道遠(yuǎn)。

3 總結(jié)與展望

目前多項(xiàng)CAR-T治療消化系統(tǒng)腫瘤的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，也涌現(xiàn)了一些振奮人心的臨床結(jié)果，但依然面臨著CAR-T治療的特異性不夠高、副作用較大和腫瘤微環(huán)境免疫抑制的挑戰(zhàn)。為解決這一系列問題，很多學(xué)者著力于研究雙靶點(diǎn)CAR-T，CAR-T聯(lián)合化療、放療和其他免疫療法的有效性和安全性。實(shí)體瘤具有豐富的腫瘤基質(zhì)，CAR-T細(xì)胞必須滲透到腫瘤基質(zhì)中才能發(fā)揮抗腫瘤作用，這可能解釋了為何CAR-T療法在實(shí)體瘤中的療效不及血液腫瘤。CAR-T療法的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是選擇腫瘤特異性抗原，然而目前研究的大多數(shù)腫瘤抗原是腫瘤相關(guān)抗原，其雖在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，但在正常組織中也有表達(dá)，因此攻擊腫瘤組織的CAR-T細(xì)胞也會(huì)對(duì)正常組織或器官造成損害。對(duì)此我們?cè)贑AR-T設(shè)計(jì)優(yōu)化方面提出一些見解：1)提高靶點(diǎn)選擇的針對(duì)性和特異性；2)開發(fā)利用多靶點(diǎn)CAR-T技術(shù)，減少脫靶效應(yīng)；3)利用細(xì)胞因子受體提高CAR-T細(xì)胞的趨化性；4)增強(qiáng)對(duì)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的抵抗力；5)增強(qiáng)CAR-T的安全性，一些“開關(guān)”設(shè)計(jì)已被開發(fā)并用于患者，可選擇性地控制CAR-T細(xì)胞的激活或失活，降低與CAR-T相關(guān)的副作用。

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