中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在疾病中的作用

沈文祥，蔣 威，馬曉宇，楊 潔，武小虎，呂亞楠，王勝義，丁學(xué)智，嚴(yán)作廷*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018）

中性粒細(xì)胞是動物外周血中最豐富的先天免疫效應(yīng)細(xì)胞，在血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫監(jiān)視的作用。當(dāng)機(jī)體受到外來入侵時，中性粒細(xì)胞迅速募集至感染部位。首先，吞噬內(nèi)化病原微生物至胞內(nèi)的吞噬體中，同時胞內(nèi)的顆粒抗菌蛋白被傳遞到吞噬體中殺傷病原；其次，胞內(nèi)具有殺菌作用的顆粒蛋白釋放到胞外中和病原微生物；當(dāng)病原太大無法被吞噬或通過進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)逃避吞噬作用時，中性粒細(xì)胞會啟動第三種模式——即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET）殺傷病原［1－2］。此外B.G.Yipp等［3］認(rèn)為，細(xì)菌在被PMN吞噬后可能將未被完全殺傷的細(xì)菌釋放到胞外，NET還可以防止這些未被完全殺死細(xì)菌的擴(kuò)散。NET是一種細(xì)胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以DNA為骨架，其上附有組蛋白、顆粒蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。當(dāng)刺激物不同時產(chǎn)生的抗菌蛋白種類數(shù)量不同，如佛波酯（phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA）刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NET包含24種蛋白，不同的銅綠假單胞菌黏液和非黏液菌株可誘導(dǎo)形成包含33種不同蛋白和多達(dá)50種不同蛋白的NET［4］。主要抗菌效應(yīng)蛋白是來自細(xì)胞核的蛋白（組蛋白、HMGB1）和顆粒蛋白酶［如彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、鈣網(wǎng)蛋白－G和蛋白酶－3］，以及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等。這些蛋白具有強(qiáng)大的殺傷病原微生物的作用。研究發(fā)現(xiàn)NET上的NE會特異性切割福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的毒力因子［5－6］。NET包含的組織蛋白酶G和蛋白酶3與NE密切相關(guān)，并可能裂解不同種類病原體的毒力因子［7］。但是，NET不僅可以殺傷病原微生物，同時對感染組織周邊的健康組織發(fā)起攻擊，如果調(diào)節(jié)異常，NET可能會導(dǎo)致免疫相關(guān)疾病的發(fā)生。Chen L.等［8］研究發(fā)現(xiàn)，NET在敗血癥中可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)正常的細(xì)胞發(fā)生焦亡。此外，最近F.P.Veras等［9］報道，SARSCoV－2可以觸發(fā)PMN釋放NET，引起肺上皮細(xì)胞死亡，暗示靶向抑制NET釋放可能是治療新冠肺炎的潛在靶點(diǎn)。

1 中性粒細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的作用

中性粒細(xì)胞也稱多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）或粒細(xì)胞，是動物機(jī)體中最豐富的白細(xì)胞。粒細(xì)胞和／或粒細(xì)胞前體通常占骨髓和血流中有核細(xì)胞的60%［10］。成熟的中性粒細(xì)胞在血液中的典型循環(huán)半衰期為6～8 h，在組織中遷移2～3 d。它們的壽命相對較短，主要用于監(jiān)視入侵的微生物。在感染期間，嗜中性粒細(xì)胞的壽命延長，粒細(xì)胞增多，并且大量嗜中性粒細(xì)胞迅速募集到感染部位。在微生物被識別和吞噬之后，中性粒細(xì)胞利用一組特殊的氧依賴和氧不依賴的殺菌劑武器來摧毀感染因子［2］。氧依賴機(jī)制包括活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而氧不依賴機(jī)制包括裂解酶和殺菌肽的脫粒和釋放［6］。此外，中性粒細(xì)胞還可以產(chǎn)生NET固定殺滅中性粒細(xì)胞不能吞噬或可以逃避脫粒釋放的殺菌肽的病原。由于這些過程在殺死大多數(shù)攝入的微生物方面非常有效，中性粒細(xì)胞承擔(dān)了抵御感染的主要細(xì)胞防御任務(wù)。

2 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成

2.1 NET形成的機(jī)制

目前已經(jīng)描述了兩種NET形成機(jī)制，即通過緩慢的（120～240 min）裂解細(xì)胞死亡機(jī)制和從活細(xì)胞中快速（5～60 min）釋放NET［11］。第一種是稱為自殺性NET形成（suicidal NETosis）的細(xì)胞死亡途徑，它始于細(xì)胞核的去分葉化和核膜的解體，持續(xù)到細(xì)胞極化喪失、染色質(zhì)解聚和質(zhì)膜破裂［12］。第二種是有活力的NET形成（vital NETosis），它可以獨(dú)立于細(xì)胞死亡發(fā)生，包括核染色質(zhì)的分泌排出，同時通過脫粒釋放顆粒蛋白［13］。這些成分在細(xì)胞外組裝，留下有活性的無核細(xì)胞體，可繼續(xù)吞噬微生物［3］。

兩種NET的形成都需要兩個主要過程：（1）中性粒細(xì)胞染色質(zhì)的解聚；（2）核膜和質(zhì)膜通透性增加。染色質(zhì)解聚主要由肽基精氨酸酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）所催化，該酶催化組蛋白精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，從而降低了組蛋白的強(qiáng)正電荷，削弱了組蛋白與DNA的結(jié)合。這種減弱的相互作用隨后解開了核小體的包裹［5，14］。此外，導(dǎo)致染色質(zhì)解聚的還有NE，NE在MPO刺激下遷移到細(xì)胞核酶解組蛋白破壞染色質(zhì)緊密結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)核的解聚［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在未干擾瓜氨酸化過程的情況下，使用NE抑制劑可以有效阻止真菌性肺炎中動物體內(nèi)NET形成［16］。

在NET形成過程中質(zhì)膜通透性增加是程序性發(fā)生的，并不是由染色質(zhì)解聚后膨脹所造成的物理性破壞的結(jié)果。目前研究發(fā)現(xiàn)，核膜和質(zhì)膜通透性增加是GSDMD成孔蛋白p30（gasdermin D p30，GSDMD－P30）在膜上打孔得以實(shí)現(xiàn)［13］。GSDMD以未激活狀態(tài)存在于細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)酶（NE、caspase）剪切后分為N端和C端結(jié)構(gòu)，目前發(fā)現(xiàn)N端具有生物活性，GSDMD－P30是GSDMD中的一種，是打孔蛋白，可以在細(xì)胞膜上打孔增加膜的通透性［13］。

2.2 NET形成的信號通路

目前對NET形成過程通路尚不完全清楚。NET形成是一個循序漸進(jìn)的過程，有幾個連續(xù)的步驟：活性氧生成；NE和MPO從顆粒向核的轉(zhuǎn)移；組蛋白瓜氨酸化；最后，細(xì)胞質(zhì)膜的破壞和染色質(zhì)的釋放［17］。

最有效且最常用的NET形成（NETosis）激活劑是PKC的直接激活物——PMA。已證明PMA對NETosis通過激活Raf／MEK／ERK信號通路后，誘導(dǎo)NADPH氧化酶組裝成功能復(fù)合物，隨后產(chǎn)生抗凋亡蛋白和活性氧（ROS）參與NETosis［18－19］。ROS通過激活MPO，活化的MPO促進(jìn)NE從顆粒中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)并酶解組蛋白，破壞染色體緊密包裹的結(jié)構(gòu)［6］。隨后MPO入核，合成次氯酸，加劇染色體解聚，從而促進(jìn)NET的釋放［20］。此外，ROS還可以通過激活肽基精氨酸酶4（PAD4），瓜氨酸化組蛋白，減少DNA與組蛋白之間的結(jié)合，從而促進(jìn)染色質(zhì)的解聚。

染色質(zhì)解聚之后，質(zhì)膜的破裂或成孔作用會引起NET形成。消皮素（GSDMD）最近被確定在自殺性和有活性的NETosis中發(fā)揮膜成孔的作用，GSDMD通常存在于靜息細(xì)胞的胞漿中［13］。當(dāng)被特定的蛋白酶切割時，會產(chǎn)生成孔片段——GSDMD－P30。在PMA誘導(dǎo)的自殺性NETosis期間，NE裂解GSDMD在中性粒細(xì)胞質(zhì)膜和顆粒膜上產(chǎn)生GSDMD－P30孔，導(dǎo)致在NETosis期間膜的破裂。GSDMD孔在NETosis期間穿透核膜，有助于NETosis過程中核的通透性增加［13］。G.Sollberger等［13］報道，GSDMD抑制劑在不影響NADPH氧化酶、NE或MPO功能的情況下阻斷了PMA誘導(dǎo)的NET代謝，強(qiáng)調(diào)了這一途徑中對膜通透性的作用。

3 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與疾病

3.1 NET在新型冠狀病毒感染中的作用

2019冠狀病毒?。–OVID－19）感染的全譜范圍從無癥狀到急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），以過度炎癥和血栓性微血管病為特征［21］。F.P.Veras等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在重癥COVID－19患者血液和肺部組織中均發(fā)現(xiàn)NET濃度增加；新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）可以直接誘導(dǎo)健康中性粒細(xì)胞釋放NET。通過SARS－CoV－2的復(fù)制、血管緊張素的釋放和絲氨酸蛋白酶的激活觸發(fā)NETosis過程。SARS－CoV－2激活中性粒細(xì)胞釋放的NET在體外促進(jìn)肺上皮細(xì)胞死亡［22］。M.Saffarzadeh等［23］研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞死亡的成分主要是組蛋白。NET引起的血栓栓塞是引起新冠病人死亡的主要原因之一。ZUO Y.等［24］報道了NET在COVID－19時引起血栓形成導(dǎo)致的動／靜脈血栓阻塞，由此導(dǎo)致的抗磷脂綜合征可能危及患者生命。NET可以作為血液標(biāo)志物判斷新冠病人的預(yù)后。H.NG等［22］對106例中度至重度新冠病人進(jìn)行為期4個月的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，新冠病人血液中NET組成的三個主要標(biāo)志物NE、cf－DNA（cell free－DNA）和citH3均顯著高于健康對照組，需要輔助呼吸和短期死亡的病人NET標(biāo)志物水平高于病情恢復(fù)較好的病人，該研究暗示可將NET作為判斷COVID－19預(yù)后的指標(biāo)。

3.2 NET與癌癥

世界衛(wèi)生組織對于判定是否為良性腫瘤的主要指標(biāo)是，癌細(xì)胞是否能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散到其他組織。最近的研究發(fā)現(xiàn)NET可能與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。T.H.Snoderly等［25］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中NETosis與增加的疾病進(jìn)展、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)，NET靶向療法已在臨床前癌癥模型中顯示成功，并可能證明在減緩或中止乳腺癌患者的腫瘤進(jìn)展方面具有重要的臨床目標(biāo)。YANG L.等［26］研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞上的跨膜蛋白CCDC25可以作為NETDNA復(fù)合物受體感知胞外DNA并激活I(lǐng)LK－βparvin（integrin－linked kinase－β－parvin）通路，增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動性。

3.3 NET與自身免疫病

自身免疫病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti－neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關(guān)性血管炎、牛皮癬和痛風(fēng)等［27］。研究表明，在形成NETs的過程中，NETosis和NET降解之間的失衡可能與自身免疫性疾病有關(guān)［28］。白細(xì)胞介素－8、ANCA和其他炎癥分子被認(rèn)為在NET形成中起關(guān)鍵作用。長期暴露在與NET相關(guān)的caspase中與自身免疫有關(guān)，并增加了全身器官損傷的機(jī)會［29］。

3.4 NET與炎癥和組織損傷

目前的研究表明，NET具有免疫保護(hù)作用，但是同時NET也可引起炎癥和組織損傷。主要原因是NET的組成成分大部分為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）。DAMPs主要是來自于自體細(xì)胞損傷釋放的物質(zhì)，它們通過模式識別受體（PRR）激活免疫系統(tǒng)［30］。NET從PMN釋放到胞外后，NET的組成成分，如來自于細(xì)胞核的高遷移率蛋白1（HMGB1）、組蛋白、DNA和來自顆粒中的β－防御素、中性粒細(xì)胞彈性酶、組織蛋白酶G（cathepsin－G）等，作為DAMPs可以引起組織損傷和炎癥［31－33］。那么這些成分是怎樣引起組織炎癥和損傷的呢？研究發(fā)現(xiàn)NET可以直接殺傷上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在感染新冠時過度的NETosis導(dǎo)致嚴(yán)重的肺上皮細(xì)胞的損傷［34］。在敗血癥和急性損傷過程中，發(fā)現(xiàn)游離的組蛋白具有損傷細(xì)胞膜完整性的能力［35］。其他的NET相關(guān)蛋白如防御素可以滲透真核細(xì)胞，NE可以破壞細(xì)胞間的緊密連接［36］。

3.5 NET調(diào)節(jié)的分子機(jī)制

微生物和內(nèi)源性刺激（例如與損傷相關(guān)的分子模式和免疫復(fù)合物）可觸發(fā)稱為NETosis的嗜中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的形成。細(xì)菌、真菌、病毒、免疫復(fù)合物和晶體對許多受體的連接通過各種下游效應(yīng)蛋白激活NETosis［37］?；罨难“暹€可以通過高糖基化終產(chǎn)物（RAGE）和P－選擇素－P－選擇素糖蛋白配體1（PSGL1）相互作用的HMGB1受體觸發(fā)NETosis［38］。通過MEK細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)活性氧，觸發(fā)MPO途徑［19］。在該途徑中，NE需要MPO介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）的氧化活化來降解細(xì)胞質(zhì)中的肌動蛋白細(xì)胞骨架，以阻斷吞噬作用［20］。然后，NE轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，通過處理組蛋白來驅(qū)動染色質(zhì)的解聚。MPO和原癌基因DEK的結(jié)合以及PAD4的激活也促進(jìn)了染色質(zhì)的解聚，這使組蛋白瓜氨酸化［39］。自噬也被認(rèn)為在NET的形成中起作用。吞噬受體通過促進(jìn)吞噬小體的形成抑制NETosis，從而響應(yīng)小型微生物，吞噬小體的形成使NE遠(yuǎn)離核［40］。唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素（Siglec 5和Siglec 9）通過限制中性粒細(xì)胞活化和ROS生成來抑制NETosis［41］。內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶抑制劑可以通過抑制NE 來阻斷NETosis。

4 展望

NET在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用，同時過度釋放的誘捕網(wǎng)會引發(fā)各種疾病，因此靶向誘捕網(wǎng)治療疾病可以作為新的研究方向。NET還可作為標(biāo)志物判斷某些疾病的嚴(yán)重程度。在NET被發(fā)現(xiàn)的早期，其捕獲微生物的能力引起了研究者們極大的熱情，但最近其致病潛力吸引了人們的關(guān)注。NET是有益還是有害與調(diào)節(jié)其形成的方式和產(chǎn)生水平有關(guān)，如組成性激活、抑制機(jī)制失調(diào)和NET產(chǎn)量過高可能是導(dǎo)致疾病的重要致病機(jī)制。因此認(rèn)為劑量、NET釋放和清除的時間調(diào)節(jié)是NET能否致病的關(guān)鍵因素。在自身免疫中，異常的NETosis可能是由于先天的耐受性被破壞導(dǎo)致的，但NET在炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中似乎發(fā)揮了主要作用。NET增強(qiáng)或抑制炎癥的能力在無菌疾病和其他未知情況下可能具有有益的作用?？紤]到大量的NET蛋白，可能會發(fā)現(xiàn)新的NET功能。更好地了解NET的功能和對動物健康的影響將能夠抑制有害屬性，而不會干擾有益屬性，并最終使我們能夠利用NET來治療疾病。