三個楸樹優(yōu)良無性系的組培快繁技術(shù)研究

胡 倩，趙天宇，張新葉，耿若楠，洪聰慧，劉 同，杜克兵*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 園藝林學學院，武漢 430070；2.湖北省林業(yè)信息技術(shù)研究中心(華中農(nóng)業(yè)大學)，武漢 430070；3.襄陽市林業(yè)科學研究所，湖北 襄陽 441052；4.湖北省林業(yè)科學研究院，武漢 430075)

楸樹(Catalpabungei)是紫葳科(Bignoniaceae)梓樹屬(Catalpa)的高大落葉喬木，常作為優(yōu)質(zhì)的用材樹種，也是著名的園林觀賞樹種，已有2000余年的栽培歷史[1-3].楸樹樹干高聳，樹冠濃密，樹姿優(yōu)美，春季嫁接苗當年可高達3～4 m，成年楸樹可高達30 m，不僅觀賞效果極佳，且其木材質(zhì)地適中、堅韌致密、耐腐蝕、耐潮濕，在各種行業(yè)中被廣泛應(yīng)用[4-5].此外，楸樹還具有極高的藥用價值，葉、樹皮、種子均可做中藥藥材，綜合利用價值極高[6].

由于楸樹自花不孕，結(jié)實量極少，種子自身的發(fā)芽率也不高，所以通過實生繁殖較困難[7].目前，生產(chǎn)上多采用嫁接和扦插的方法生產(chǎn)種苗，但楸樹扦插生根較困難，嫁接成本高，而且受季節(jié)限制，所以這些方法都無法滿足短期內(nèi)提供大量苗木的需求.采用組織培養(yǎng)的方法，不僅可以提高繁殖系數(shù)，而且速度快、成本低、不受季節(jié)環(huán)境的限制[8-10].目前，雖有一些關(guān)于楸樹的組培快繁研究的報道，但不同品種的基因型不同，其內(nèi)源激素的種類和濃度存在差異，組培過程中所需要的營養(yǎng)和外源激素用量也不完全相同，從而導致不同品種的離體快繁體系存在差異[11-13].因此，有必要針對特定優(yōu)良品種建立相應(yīng)的組培快繁體系.本研究以開花量大的楸樹優(yōu)良單株為試材，進行組織培養(yǎng)快繁研究，以期建立完整高效的離體快繁技術(shù)，為苗木的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

楸樹優(yōu)良單株1#(簡稱DH1)、2#(簡稱DH2)和5#(簡稱DH5)，這3個優(yōu)良單株均由襄陽市林業(yè)科學研究所從當?shù)匾吧衢辟Y源中篩選得到，具有開花量大的特點，可作為園林觀賞材料.

1.2 基本培養(yǎng)基

在植物組織培養(yǎng)中，常使用MS、1/2MS、N6、DKW和WPM培養(yǎng)基，根據(jù)不同材料選用合適的培養(yǎng)基，一般來說，MS培養(yǎng)基含的營養(yǎng)元素適合大部分植物生長，DKW和WPM培養(yǎng)基適合一般木本植物生長，因此本試驗選用MS、DKW、WPM三種常用的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基.在7-9月，晴天采集DH1、DH2和DH5的幼嫩帶芽莖段，用少量洗潔精浸泡2 min，刷去表面灰塵，之后放入大燒杯中，用無紡紗布封口后，蒸餾水沖洗2 h；隨后用100 mg/L PVP浸泡5 min，200 mg/L鏈霉素+400 mg/L青霉素液浸泡15 min，用蒸餾水再次清洗30 s.轉(zhuǎn)入超凈工作臺中，用70%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗2次，30 s/次；再用0.1%氯化汞消毒6.5 min，無菌水沖洗5次，30 s/次，用無菌濾紙吸干外植體表面水分，切成1～2 cm的帶芽莖段，分別接種到MS、DKW、WPM基本培養(yǎng)基中(不添加任何激素).培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計外植體的污染率(P)與褐化率(B)，以篩選合適的基本培養(yǎng)基.P=(N1/N)×100，其中，P表示污染率，N1表示污染外植體數(shù)量，N表示接種時外植體總數(shù).B=(N2/N)×100，B表示褐化率，N2表示褐化外植體數(shù)量，N表示接種時外植體總數(shù).

1.3 培養(yǎng)條件

接種時，每個處理3次重復，每次重復5瓶，每瓶培養(yǎng)基接種2個外植體，即每種材料接種30個莖段.培養(yǎng)基均進行高壓蒸汽滅菌(121 ℃，100 kPa)20 min.接種后，將材料置于(25±2)℃的組培室內(nèi)培養(yǎng)，光照強度為1 500～2 000 lx，光照時間為16 h/d.

1.4 初代培養(yǎng)

通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，當NAA濃度高于0.05 mg/L時，不利于腋芽萌發(fā)，且根據(jù)張燁然等[14]研究數(shù)據(jù)，將激素種類設(shè)置為6-BA(1.0、2.0 mg/L)、IBA(0、0.1、0.2 mg/L)、NAA(0、0.01、0.03 mg/L)，共8種培養(yǎng)基(IM1～IM8；表1)，以DKW為基本培養(yǎng)基，添加1.0 g/L活性炭+0.8%瓊脂+2.5%蔗糖，pH=5.8；用DH1、DH2和DH5幼嫩帶芽莖段為試材，經(jīng)初代消毒后接種于培養(yǎng)基中.接種30 d后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率(G)，以篩選合適的初代培養(yǎng)基.G=(N3/N)×100%,其中，G表示腋芽萌發(fā)率，N3表示萌芽外植體數(shù)量，N表示接種時外植體總數(shù).

表1 初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中的激素設(shè)置

1.5 增殖培養(yǎng)

張燁然等[14]研究顯示6-BA和IBA對楸樹試材的增殖系數(shù)影響顯著，本試驗在其基礎(chǔ)上依照張蕊等[15]對NAA梯度篩選的試驗結(jié)論，進一步篩選不同濃度NAA與6-BA、IBA組合對其增殖系數(shù)的影響，因此將激素種類設(shè)置6-BA(0、2、3 mg/L)、IBA(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)、NAA(0、0.05、0.20 mg/L)，共11種培養(yǎng)基(PM1～PM11；表1)，以DKW為基本培養(yǎng)基，添加2.5%蔗糖+0.8%瓊脂，pH=5.8；以初代培養(yǎng)中萌發(fā)的腋芽為試材，在腋芽高1～2 cm時，切下腋芽接種于增殖培養(yǎng)基中.培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)(M)，以篩選適宜的增殖培養(yǎng)基，M=(M1/M2)×100%.其中，M表示增殖系數(shù)，M1表示培養(yǎng)35 d時的有效芽數(shù)，高于1 cm的芽記為有效芽；M2表示接種時的總芽數(shù).

1.6 生根培養(yǎng)

以DH1、DH2和DH5高于2 cm的試管苗為試材，接種于生根培養(yǎng)基中.以DKW為基本培養(yǎng)基，添加2.5%蔗糖+0.8%瓊脂，pH=5.8；激素種類設(shè)置NAA(0、0.1、0.2 mg/L)、IBA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)，共7種培養(yǎng)基(RM1～RM7；表1)培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計根系數(shù)量、根長和生根率(R)，以篩選適宜的生根培養(yǎng)基.R=(R1/R2)×100%，其中R表示生根率，R1表示培養(yǎng)30 d生根苗數(shù)，R2表示接種時總芽數(shù).

1.7 數(shù)據(jù)分析

表格中的數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=3).所有試驗數(shù)據(jù)采用SAS8.1統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)、多重比較(Duncan’s).百分數(shù)經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)換后再用于方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基篩選

DH1、DH2和DH5莖段接種20 d后的褐化率和污染率，以及接種30 d后的腋芽萌發(fā)率見表2.3種材料在MS與WPM培養(yǎng)基中的腋芽萌發(fā)率相對較低，幼芽弱小，大小不均一，部分葉片黃綠，且玻璃化幼芽比例較高，而在DKW培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率相對較高，且幼芽生長健壯，大小均一，葉片深綠.DH1、DH2和DH5的表現(xiàn)基本一致，認為DKW更適合作為3種材料的基本培養(yǎng)基(表2).

表2 基本培養(yǎng)基篩選結(jié)果

2.2 初代培養(yǎng)效果

與DKW基本培養(yǎng)基相比，添加外源激素(6-BA、NAA、IBA)顯著提高了外植體的腋芽萌發(fā)率.DH1、DH2和DH5在接種后6～8 d腋芽開始萌發(fā).8種初代培養(yǎng)基中，DH1和DH2以IM5的腋芽萌發(fā)率最高，分別達到83.33%和86.67%，顯著高于其余7種培養(yǎng)基(P<0.05；表3)；DH5與DH1、DH2有所不同，以IM6的腋芽萌發(fā)率最高，達到80.00%，但與IM5的腋芽萌發(fā)率(70.00%)差異不顯著(P>0.05).因此，認為可選擇IM5，即DKW+0.8%瓊脂+1.0 g/L活性炭+2.5%蔗糖+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA作為3種材料的初代培養(yǎng)基，其萌發(fā)的幼芽生長健壯(圖1).

表3 初代培養(yǎng)的腋芽萌發(fā)率

圖1 DH1、DH2和DH5的初代培養(yǎng)

2.3 增殖培養(yǎng)效果

與不添加激素的PM1相比，外源激素(6-BA、NAA、IBA)顯著提高了DH1、DH2和DH5的增殖系數(shù)(表4)，但3種材料之間的表現(xiàn)不完全一致.培養(yǎng)35 d時，DH1和DH2均以PM10的增殖系數(shù)為最高，分別達到6.53和6.70，為PM1的4.77倍和3.79倍，且幼苗健壯.DH5則以PM11的增殖系數(shù)為最高，達到5.73，為PM1的4.66倍，但與PM10的增殖系數(shù)(5.47)差異不顯著(P>0.05).綜合而言，認為PM10，即DKW+0.6%瓊脂+2.5%蔗糖+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA較適宜3種材料的增殖培養(yǎng)(圖2).

圖2 DH1、DH2和DH5的增殖培養(yǎng)

表4 增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)

2.4 生根培養(yǎng)效果

與不添加激素的RM1相比，外源激素(NAA、IBA)顯著促進了DH1、DH2和DH5的生根率、生根數(shù)量與長度(P<0.05；表5).接種30 d時，在RM1中，DH1、DH2和DH5的生根率分別為20%、6.67%和0，且根系數(shù)量少，長度短.在RM2～RM7中，三者的生根情況均優(yōu)于RM1，但不同材料的表現(xiàn)不完全相同.DH1以RM5的生根效果最好，生根率最高(100%)，根系數(shù)量最多(9.37)，根長最長(4.96 cm).DH2在RM5中的生根率最高(100%)，根系數(shù)量最多(8.50)，而在RM6中根長最長(5.14 cm)，但與RM5(4.87 cm)中的根長差異不顯著(P>0.05).對于DH5，在RM6中的生根效果最好，生根率最高(100%)，根系數(shù)量最多(7.70)，根長最長(4.83 cm).總體而言，DH1、DH2和DH5在RM5和RM6中均能夠獲得較好的生根效果，除DH1與DH2的生根數(shù)量在兩種培養(yǎng)基之間存在顯著差異外，其余指標的差異均不顯著.因此，RM5和RM6均適宜3種材料的生根培養(yǎng)，即DKW+0.8%瓊脂+2.5%蔗糖+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA或DKW+0.8%瓊脂+2.5%蔗糖+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA(圖3).

表5 生根培養(yǎng)試驗結(jié)果

注：表中的數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=3)；位于同列中的不同字母表示差異顯著(P<0.05).

圖3 DH1、DH2和DH5的生根培養(yǎng)

3 結(jié)論與討論

不同基本培養(yǎng)基所提供的營養(yǎng)成分有所不同，培養(yǎng)的效果亦不同，是決定組培成敗的關(guān)鍵因素.目前，楸樹中已報道的基本培養(yǎng)基主要包括1/2 MS、MS、WPM、DKW和N6[16-20].李小艷等[16]研究了N6、DKW和WPM 3種培養(yǎng)基對楸樹初代腋芽萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)在N6培養(yǎng)基中，外植體萌芽較快，但20 d后開始出現(xiàn)頂芽變褐，繼而壞死的現(xiàn)象；在DKW培養(yǎng)基中，腋芽分化較N6的慢，接種15 d后大部分葉片才開始生長，但25 d后葉片大而綠，莖粗壯，新葉生長旺盛；在WPM培養(yǎng)基中，腋芽分化最慢，誘導率最低，后期還易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象.本研究中，DH1、DH2和DH5在DKW培養(yǎng)基中的腋芽萌發(fā)率明顯高于MS和WPM培養(yǎng)基，且幼芽生長健壯，大小均一，葉片深綠，該結(jié)果與李小艷[16]的研究結(jié)果相似.因此，認為DKW更適合作為DH1、DH2和DH5的基本培養(yǎng)基.

從已報道的楸樹初代培養(yǎng)結(jié)果來看，不同楸樹種類或品種對培養(yǎng)基成分，尤其是激素種類與濃度的要求有所不同.例如，孟路等[13]發(fā)現(xiàn)朝霞楸(Catalpabungei‘Zhaoxia’)和云朵楸(Catalpabungei‘Yunduo’)的莖段在2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA上腋芽效果較好，萌發(fā)率達80%以上，而洛楸1號(Catalpabungei‘Luoqiu1’)和魯楸1號(Catalpabungei‘Luqiu1’)的莖段在1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA上腋芽萌發(fā)較好，可達100%.張燁然[14]等發(fā)現(xiàn)6-BA+NAA組合并不能促進楸樹(QS2)和滇楸(DQ72)的腋芽萌發(fā)，而6-BA+IBA有利于促進腋芽萌發(fā)，且1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA較適合初代培養(yǎng).本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA較適宜DH1、DH2和DH5的初代培養(yǎng)，接種30 d后腋芽萌發(fā)率均達到80%左右，但不同無性系之間存在一定差異，這與孟路[13]和張燁然[15]的研究結(jié)果相似.

繼代增殖培養(yǎng)是組培快繁的關(guān)鍵，其中增殖系數(shù)是衡量繁殖效率的重要指標，與外源激素的種類與濃度密切相關(guān)[17-19].目前報道的用于楸樹增殖培養(yǎng)的激素主要包括IBA、NAA和6-BA等[20-21]，但不同楸樹材料適宜的激素種類與濃度有所不同，增殖效果亦存在較大差異，這可能與材料的基因型以及幼嫩程度有關(guān)[22-23].例如，孟路等[13]發(fā)現(xiàn)在含0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，不同楸樹品種增殖所需適宜的6-BA濃度有所不同，1.0 mg/L 6-BA最適宜洛楸1號增殖，增殖系數(shù)為4.70；1.5 mg/L 6-BA 最適宜云朵楸和魯楸1號增殖，增殖系數(shù)分別為3.38和5.68；3.0 mg/L 6-BA最適宜朝霞楸增殖，增殖系數(shù)可達5.49.張蕊等[15]研究發(fā)現(xiàn)6-BA和NAA的交互作用對周楸20號增殖系數(shù)的影響不顯著，而NAA和6-BA對其增殖系數(shù)的影響顯著，兩者濃度的比值與增殖系數(shù)有一定關(guān)系，當NAA為 0.15 ～ 0.20 mg/L，6-BA為0.8～1.6 mg/L時，增殖系數(shù)較高.在本研究中，3種材料對6-BA和IBA濃度的需求亦不完全相同.DH1和DH2以培養(yǎng)基中添加3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA時的增殖系數(shù)最高，分別達到6.53和6.70，而DH5則以添加3.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA時的增殖系數(shù)最高，為5.73.

生根培養(yǎng)是建立高效組培快繁體系的重要步驟，直接影響組培苗的生產(chǎn)應(yīng)用效率.從已有文獻來看，楸樹組培苗生根并不十分困難，現(xiàn)已報道的楸樹生根率大部分在70%～100%之間，生根數(shù)量介于2.0～20.0條，根長介于3～10 cm，但不同楸樹種類或品種適宜的生根培養(yǎng)基成分并不完全相同[12-13，23].例如，孟路等[12]發(fā)現(xiàn)朝霞楸在WPM+0.1 mg/L NAA+0 g/L活性炭培養(yǎng)基上，生根率最高達97%，平均根系數(shù)量可達6.7條，根長最大達4.88 cm.聶琳等[23]在1/2 MS+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)楸樹幼芽，生根率可達100%，平均根數(shù)10條，平均根長4.00 cm.本研究發(fā)現(xiàn)，以DKW+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA或DKW+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA培養(yǎng)DH1、DH2和DH5均可取得較好的生根效果，接種6～7 d即開始生根，30 d時三者的生根率均達到95%以上，生根數(shù)量介于7.13～9.37條，根長介于4.6～5.0 cm.