基于網(wǎng)絡藥理學探討槲皮素治療IPF的分子機制

張明昌，陳 威，諶小軍，李 敏，葛正行

(1.貴州中醫(yī)藥大學 研究生院，貴陽 550000；2.貴州中醫(yī)藥大學 第二附屬醫(yī)院，貴陽 550000)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種常見的以氣道重塑、慢性炎癥、肺泡破壞和纖維化為特征的致死性間質(zhì)性肺病[1]，主要表現(xiàn)為進行性的呼吸困難和肺功能惡化，最終因呼吸衰竭而死[2]，其發(fā)病率高、生存率低、預后不良，已成為危害人類健康的主要疾病，尋找有效可靠的治療藥物是目前亟待解決的問題之一.目前僅有吡非尼酮和尼達尼布被批準用于治療IPF[3-4]，但研究顯示吡非尼酮對延長IPF患者生存時間的作用并不理想[5].此外，巨大的經(jīng)濟負擔已成為IPF患者治療的阻力[6].

近年研究顯示中醫(yī)藥治療IPF具有良好的療效及安全性[7].槲皮素是自然界廣泛存在的黃酮類化合物中的一種，可從多種中草藥中進行提取，具備廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗血小板聚集、抗氧化應激以及抗感染等，此外大量實驗研究表明其還具有顯著的抗肺纖維化的重要作用.槲皮素可恢復衰老的IPF成纖維細胞對促凋亡刺激的敏感性，有效降低博來霉素致小鼠肺纖維化程度，減緩肺纖維化進程，減輕肺部病理損傷，保護肺臟[8-9].因此，槲皮素具有一定防治IPF的藥理基礎，但其產(chǎn)生作用的有效成分及作用于IPF的通路、靶點尚不清楚.網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，對“藥物、疾病、基因、靶點”進行網(wǎng)絡分析，挖掘藥物治療疾病多靶點的內(nèi)在聯(lián)系的新學科，主要以系統(tǒng)生物學、多向藥理學及計算機分析技術(shù)為基礎，通過構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡，可整體系統(tǒng)地分析藥物成分與疾病之間的相互作用關(guān)系，從分子生物學層面多方位揭示中藥有效成分治療疾病的潛在作用機制，對藥物作用機制研究以及中藥新藥創(chuàng)新研發(fā)具有重要意義[10].因此，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學方法對槲皮素治療IPF的作用機制進行研究，并通過分子對接技術(shù)驗證化合物-潛在靶點的對接活性，為后期的臨床研究以及新藥研發(fā)提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 獲取槲皮素結(jié)構(gòu)及靶點信息

從PubChem數(shù)據(jù)庫[11](pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載槲皮素的3D-sdf格式及Canonical SMILES號，將其分別導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[12]、Targetnet數(shù)據(jù)庫[13]進行靶點預測，根據(jù)可能性(probability)大于0進行篩選，合并去重后得到槲皮素的相關(guān)靶點蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點蛋白轉(zhuǎn)換為對應的人源性基因名，方便進一步的數(shù)據(jù)分析.

1.2 IPF相關(guān)疾病基因獲取及槲皮素治療IPF潛在靶點預測

OMIM(https://omim.org)、DISGENET(http://www.disgenet.org/home/)、比較毒物基因組學數(shù)據(jù)庫[14](CTD)等數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶點，輸入關(guān)鍵詞為“idiopathic pulmonary fibrosis”，合并去重后獲得與TPF相關(guān)的靶點基因.將藥物靶點及疾病靶點導入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)獲取兩者的交集基因，視為槲皮素治療IPF的潛在靶點基因.

1.3 交集基因蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建及核心節(jié)點網(wǎng)絡篩選

將槲皮素治療IPF的潛在靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫[15]，限定物種為人，去除游離基因后得到交集基因的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡，保存其TSV格式文件，并導入Cytoscape3.7.1軟件[16]進行可視化及網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)分析，以degree值反映基因作用大小，并根據(jù)degree值大小獲取核心節(jié)點網(wǎng)絡.

1.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析

將交集基因?qū)牍δ茏⑨屔镄畔W分析平臺DAVID數(shù)據(jù)庫[17]進行生物過程、分子功能、細胞組分的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析.將所得結(jié)果根據(jù)P值降序排列(P<0.05)，并取基因富集數(shù)最多的前20條信息進行可視化.

1.5 構(gòu)建“化合物-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡

將槲皮素、交集基因及相關(guān)通路信息導入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡.該網(wǎng)絡中，節(jié)點代表化合物、靶點、通路及疾病，連線代表節(jié)點之間的相互作用.經(jīng)拓撲網(wǎng)絡分析后采用degree值評判節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要性，degree數(shù)越大者，說明其網(wǎng)絡中的相關(guān)性越大、重要性越強.

1.6 分子對接

將化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡中節(jié)點度數(shù)最高的前3個靶點作為受體，將其與槲皮素進行分子對接，以驗證槲皮素與靶點蛋白的結(jié)合活性.從PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中獲得核心靶點受體的人源性蛋白及其配體復合物，將從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載的槲皮素的3D-SDF結(jié)構(gòu)則作為配體，利用PyMOL軟件去除靶蛋白的水分子、配體，將SDF三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為PDB格式，用AutoDock Tools對受體和配體進行預處理后保存為PDBQT格式待用.最后利用AutoDock Vina軟件[18]對配體及受體進行分子對接.

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素潛在靶點的獲取

通過PubChem數(shù)據(jù)庫中獲得槲皮素的結(jié)構(gòu)信息，如表1、圖1所示.從Targetnet、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中篩選出IPF靶點并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫校對后，合并去重后得到185個潛在靶點基因.按照相關(guān)性(Probability>0)進行排序，選取前15個基因名稱和靶點展示，如表2所示.

表1 槲皮素的結(jié)構(gòu)信息

表2 槲皮素排名前15的潛在靶點

2.2 IPF疾病基因及槲皮素治療IPF潛在靶點

從OMIM、DISGENET、CTD數(shù)據(jù)庫中獲取IPF相關(guān)基因靶點共有3 995個.將IPF疾病基因與槲皮素靶點基因通過Venny映射篩選出共同靶點105個，將其視為槲皮素治療IPF的潛在靶點基因，如圖2所示.

圖1 槲皮素的2D分子結(jié)構(gòu)圖圖2 槲皮素與IPF靶點韋恩圖

2.3 槲皮素治療IPF潛在靶點的PPI網(wǎng)絡

將String數(shù)據(jù)庫得到的蛋白相互作用PPI信息的“TSV”文件導入Cytoscape 3.7.1軟件制作PPI網(wǎng)絡圖，共涉及102個節(jié)點，780條邊，如圖3所示.其中節(jié)點表示蛋白質(zhì)，邊表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，該網(wǎng)絡中超過2倍中位數(shù)degree值(18)的靶點蛋白有26個，如表3所示，視其為核心靶點蛋白，說明上述靶點很可能是槲皮素治療IPF的關(guān)鍵.

圖3 槲皮素治療IPF潛在靶點PPI網(wǎng)絡

表3 槲皮素治療IPF的核心靶點

2.4 GO和KEGG分析

基于DAVID數(shù)據(jù)庫，對105個交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析(P<0.05)，通過微生信在線作圖網(wǎng)站將分析結(jié)果進行可視化，結(jié)果顯示：GO功能富集分析得到GO條目327條(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目216條，包括：蛋白質(zhì)自身磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、氧化還原過程等；細胞組成(CC)條目40條，包括：細胞質(zhì)、核漿、線粒體、細胞外區(qū)域等；分子功能(MF)條目71條，包括：蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白激酶活性相同蛋白結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等，選取富集基因數(shù)最多的前10條條目進行展示，如圖4所示.KEGG通路富集分析得到74條信號通路(P<0.05)，涉及癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路等，如圖5所示.

圖4 GO功能富集分析結(jié)果 圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.5 化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡

槲皮素治療IPF的靶點-通路網(wǎng)絡如圖6所示.右側(cè)藍色倒三角代表槲皮素與IPF的交集靶點，右側(cè)黃色三角代表基因富集數(shù)最多的前20條通路，進一步利用Network Aalyzer插件對該網(wǎng)絡進行拓撲分析，結(jié)果顯示：AKT1、PIK3CG、RELA等靶點和癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路等信號通路的degree值較高，分別為19、18、13、19、17、13，說明上述靶點和通路在該生物網(wǎng)絡中具有重要作用.因此，可認為槲皮素可能通過作用于AKT1、PIK3CG、RELA等靶點，介導癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路等對IPF產(chǎn)生生物學效應.

圖6 槲皮素治療IPF的化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡圖

2.6 分子對接結(jié)果

為進一步研究槲皮素與關(guān)鍵靶點間的相互作用關(guān)系，利用AutoDock Vina軟件進行分子對接，對接結(jié)果如表4、圖7所示.一般認為對接分數(shù)小于-7.0表明活性成分與靶點具有強烈的結(jié)合活性，小于-5.0表明兩者有較好的結(jié)合活性，小于-4.25表明有一定的結(jié)合活性[19].

表4 槲皮素與關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果

圖7 槲皮素degree值最高的前3個靶點的分子對接圖

3 討論

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種原因不明的以慢性、進行性肺間質(zhì)纖維化為主要特征的肺系疾病，其發(fā)病機制復雜，可能與炎癥反應、肺組織的不均勻受累、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的激活，上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等有關(guān)[20].槲皮素是多種中藥中可被人體吸收代謝的有效成分之一，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保護、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學活性[21],近年來諸多學者對槲皮素抗肺纖維化的生物學效應進行較為深入的研究，藥理研究表明槲皮素能夠通過調(diào)控Smad7信號來實現(xiàn)緩解TGF-β誘導的小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞NIH3T3纖維化[22]，此外，槲皮素能有效抑制實驗大鼠的肺纖維化進展，同時有效促進肺組織的自我修復[23]，但其作用靶點及通路尚不完全明確，因此，本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法構(gòu)建槲皮素-IPF-共同靶點PPI網(wǎng)絡等，系統(tǒng)分析槲皮素治療IPF的作用機制.

通過OMIM等相關(guān)數(shù)據(jù)庫，篩選出槲皮素及IPF相關(guān)基因，取交集后共得出槲皮素與IPF共同靶點105個，占槲皮素預測相關(guān)基因的56.76%，表明槲皮素可有效作用于IPF，發(fā)揮其生物學效應，進一步通過化合物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡拓撲分析，發(fā)現(xiàn)槲皮素通過AKT1、PIK3CG、RELA等靶基因介導癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路等發(fā)揮治療IPF的作用.

AKT1是絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)家族中的一個亞型，其通過促使下游底物的磷酸化來參與細胞生長、代謝、增值、凋亡等重要細胞生物學過程[24].AKT1可通過mTOR蛋白磷酸化而激活，并促進相關(guān)蛋白表達，進而促進基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，在纖維化過程中具有重要作用[25].研究表明，通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路表達，可提高肺組織細胞自噬活性，緩解肺纖維化進程[26].研究證實，槲皮素可以通過抑制PI3K/Akt信號通路，從而抑制人胚肺成纖維細胞地增值[27].此外，在肺纖維化早期通過抑制p-AKT表達，可以起到抗肺纖維化的作用[28].Ras是PTKs介導的信號通路中的關(guān)鍵蛋白.上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肺肌成纖維細胞形成的重要過程.大量研究表明，Ras/ ERK1/2信號通路在肺纖維化中具有重要作用.成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)可通過刺激Ras/ERK1/2的激活，負調(diào)控TGF-β1誘導的EMT來抑制肺纖維化[29].目前認為IPF是引發(fā)肺癌的高危因素，會增加患肺癌的風險，因此涉及多個癌癥信號通路，可能與異常成纖維細胞增殖、表觀遺傳和遺傳變化、細胞間通訊減少等有關(guān).RELA是核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-kB)家族中的成員之一，是一種廣泛存在于真核生物內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-kB通路在細胞增殖、存活、早期病毒應答及細胞因子分泌、促炎等多方面具有重要作用[30].研究證實槲皮素能夠抑制NF-kB通路，從而減少大鼠炎癥細胞及TNF-α等的釋放，達到緩解肺纖維化進展的目的[31].PIK3CG是IB型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的亞型，主要在免疫細胞與內(nèi)皮細胞中表達，參與免疫應答[32].PI3K/AKT信號通路可以調(diào)節(jié)下游與炎癥反應密切相關(guān)的NF-kB信號的激活[33].動物實驗表明，花椒有效成分可下調(diào)PIK3CG和p-NF-kB的表達，從而減輕小鼠足爪組織中的炎癥反應[34].IPF的具體機制目前尚不明確，目前認為自身免疫功能異常與炎癥反應是導致IPF發(fā)病的重要因素，而PIK3CG有參與機體免疫應答、調(diào)節(jié)炎癥反應的作用.因此，我們預測槲皮素可調(diào)控RELA、PIK3CG基因介導其下游通路發(fā)揮生物效應，但仍需進一步實驗驗證.分子對接結(jié)果表明，槲皮素與AKT1、PIK3CG、RELA 等靶點的結(jié)合能均小于-5kJ/mol，均可生成氫鍵，說明其與潛在靶點的結(jié)合性較高，因此推測，槲皮素未來可能成為治療IPF的有效化合物之一，可為新藥的研發(fā)提供新思路.

本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)分析了槲皮素在治療IPF中的分子生物學機制，得出了槲皮素治療IPF的潛在靶點，涉及的分子功能、生物過程及作用通路，為中醫(yī)藥治療IPF提供了新的研究思路.雖然本研究所提及的一些通路已被證實有效，但由研究結(jié)果可知，槲皮素可通過多靶點介導多通路發(fā)揮治療作用，因此仍值得進一步研究.運用網(wǎng)絡藥理學發(fā)現(xiàn)的其他未被驗證的靶點及通路有待進一步研究證實.目前網(wǎng)絡藥理學研究所涉及的數(shù)據(jù)庫存在數(shù)據(jù)不全、更新速度慢等不足，對研究結(jié)果存在一定影響，因此，后期將結(jié)合具體的實驗研究驗證上述預測結(jié)果，為槲皮素治療IPF提供更科學的理論和實驗依據(jù).