不同日齡的Rncat 小鼠晶狀體組織γS-晶狀體蛋白G489A突變體表達觀察

商文文，陳欣如，婁秉盛，陳雪藝

1 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科，烏魯木齊 830054；2 新疆維吾爾族自治區(qū)疾病預防控制中心

先天性白內障是一種晶狀體透明性眼病，可導致兒童視力障礙和失明。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，全球有超過1400 萬例兒童因雙側白內障致盲，占失明的50%以上［1］。晶狀體透明性和折射率主要依靠晶狀體蛋白。到目前為止，在編碼晶狀體的蛋白質中已發(fā)現(xiàn)超過266 個基因突變可導致先天性白內障［2］。以上研究多在分子層面探索導致先天性白內障發(fā)生的機制，而對具有生物學功能的突變體（蛋白）相關研究較少。Rncat 小鼠是一種自發(fā)發(fā)育和遺傳特性與人類白內障很接近的近交系常染色體隱性遺傳小鼠品系，此類小鼠編碼γS-晶狀體蛋白的Crygs基因在外顯子3第489位由純合子G突變?yōu)锳［3］，導致正常γS-晶狀體蛋白碳端有16個氨基酸被截斷，產生了γS-晶狀體蛋白G489A 突變體（以下簡稱γS-G489A 突變體），最終可導致小鼠雙眼單純性核性白內障。2020 年6 月—2021 年1 月，我們觀察并比較γS-G489A 突變體在不同日齡小鼠晶狀體組織中的表達變化，以期了解該突變體在Rncat小鼠晶狀體蛋白變性中的作用?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 出生第3、20、40、60 天的Rncat 小鼠（先天性白內障模型小鼠）各4 只，出生第3、20、40、60 天沒有白內障的正常昆明小鼠各4 只，雌雄不限，均無特定病原體（SPF 級），由新疆維吾爾族自治區(qū)實驗動物中心提供。雙氧水，DAB 免疫組織化學顯色試劑盒（E670033-1000）；蘇木素染色液（E607317-0100，BBI）；中性樹膠封片劑（E675007-0100，BBI）；石蠟切片機（LEICA RM2125RT）；顯微鏡（OLYMPUS BX53）。其他試劑均為國產分析純/符合實驗要求。

1.2 不同日齡Rncat、正常昆明小鼠晶狀體組織γSG489A 突變體表達觀察 分別取出生第3、20、40 和60 天的Rncat 小鼠和正常昆明小鼠，脊椎脫臼處死小鼠，顯微鏡下完整取出小鼠晶狀體及囊膜，10%中性緩沖液甲醛固定24 h，-20 ℃保存。將保存眼球組織脫水、透明、浸蠟、包埋后常規(guī)組織學切片。運用免疫組織化學PV二步法標準流程進行染色，使用免疫組化油性筆，圈出組織樣本位置，滴加3%的H2O2-甲醇，室溫15 min。滴加兔抗鼠多抗隆一抗（稀釋倍數(shù)為1∶400）。滴加即用型HRP標記的鼠二抗，室溫孵育45 min。DAB顯色液濕盒顯色，蒸餾水終止。蘇木素復染5～10 min。1%鹽酸-乙醇脫色10-15 s，蒸餾水終止，PBST（pH 7.4 左右）反藍5～10 min。梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后顯微鏡觀察并拍片。觀察不同日齡Rncat小鼠晶狀體組織結構，觀察晶狀體核區(qū)是否出現(xiàn)棕色免疫物沉積，有沉積則表示γS-G489A突變體呈陽性表達；觀察晶狀體上皮細胞核是否超出赤道部，向前極、后極、深層皮質和核區(qū)遷移。并用Image J 軟件對不同日齡Rncat、正常昆明小鼠晶狀體組織γS-G489A 突變體陽性表達面積進行定量計算（%）；重復3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以表示，兩組間比較用配對t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

出生第3 天的Rncat 小鼠晶狀體皮質區(qū)可見少量突變體，呈淡棕色，核區(qū)淡染；晶狀體上皮細胞在前囊膜下呈單層排列，接近赤道部時明顯過度增殖，可見多層核紊亂排列；深層皮質和核區(qū)明顯見到嗜堿性染色的晶狀體上皮細胞核（見圖1B）。出生第20 天時Rncat小鼠晶狀體淺層皮質和核區(qū)染色稍加深；赤道部上皮細胞向前、后極遷移，可在深層皮質和核區(qū)觀察到嗜堿性藍染的晶狀體上皮細胞核；核區(qū)有局限性棕染，纖維細胞變性短縮、粗糙紊亂（見圖2B）。出生第40 天時Rncat 小鼠晶狀體淺層皮質和核區(qū)深染，核區(qū)免疫反應比出生第3、20 天時明顯；晶狀體上皮細胞向前極遷移，深層皮質和核區(qū)仍明顯可見上皮細胞核；纖維細胞變性紊亂（見圖3B）。出生第60 天時Rncat 小鼠晶狀體上皮細胞不易觀察；核區(qū)反應最顯著，呈邊界清楚的深棕色，其間依稀可見上皮細胞核（見圖4B）。正常小鼠出生第3、20、40、60 天時晶狀體組織免疫組化染色結果基本一致，可以在晶狀體皮質區(qū)檢測到少量突變體，呈淡棕色；上皮細胞在前囊膜下呈單層整齊排列，向后延伸至赤道部，可在赤道部淺層皮質中觀察到嗜堿性藍染的晶狀體上皮細胞核；核區(qū)幾乎為背景色，無上皮細胞核分布（見圖1A、2A、3A、4A）。

圖1 Rncat、正常昆明小鼠晶狀體組織γS-G489A突變體分布情況（×40）

3 討論

γS-晶狀體蛋白是晶狀體中的可溶性結構蛋白，廣泛分布于脊椎動物中，在進化上高度保守，由位于人類第3 號染色體和小鼠第16 號染色體上的Crygs基因編碼，包含178 個氨基酸殘基，全長702 bp，相對分子質量為20.8 kDa［4］，主要維持晶狀體的折射率和透明性。到目前為止，已報道了多個Crygs突變與先天性白內障相關，包括G18V［5］、V42M［6］、D26G［7］、Y67N［8］、T67A［9］、G57W［10］、S39C［11］、F30S［12］等，不同位點的突變導致的先天性白內障的表型各不相同。

Rncat 小鼠是新疆維吾爾族自治區(qū)實驗動物研究中心在1993 年發(fā)現(xiàn)的一種近交系自發(fā)突變常染色體隱性遺傳品系小鼠，該小鼠出生半個月左右即可觀察到晶狀體出現(xiàn)混濁，出生一個月時可觀察到晶狀體核區(qū)完全混濁。在本研究中，我們對不同出生日齡正常昆明小鼠和Rncat 先天性白內障模型小鼠γS-晶狀體蛋白G489A 突變體采用免疫組織化學染色法進行了定性檢測。結果發(fā)現(xiàn)，出生第3 天Rncat 小鼠和正常小鼠均在晶狀體皮質中檢測到少量γS-G489A 突變體表達，表明此時核區(qū)還沒有不溶性蛋白成分聚集，晶狀體仍為透明狀態(tài)；出生第20、40、60 天時對照組γS-晶狀體蛋白突變體雖也有少量表達，但彼此相差甚微，無統(tǒng)計學差異，可將其看作非特異性表達。

γS-晶狀體蛋白包含特殊的希臘鍵超二級基序結構，每個希臘關鍵基序由約40 個氨基酸殘基組成，這些氨基酸殘基折疊成四條連續(xù)的反平行鏈，兩個連續(xù)的希臘關鍵基序圍繞一個近似的二分體對稱地插入，形成一個充滿疏水側鏈的楔形β-折疊［13］。當編碼蛋白的基因發(fā)生突變時，亞基間相互作用遭到破壞，造成晶狀體蛋白溶解性降低，發(fā)生不可逆性聚集。Rncat小鼠出生第20 天時突變體已迅速在核區(qū)聚集，小鼠出現(xiàn)雙眼核性混濁，出生第60 天時不溶性突變體蛋白已幾乎布滿整個晶狀體核區(qū)，是造成小鼠雙眼不可逆核性混濁的原因。

另一方面，與正常小鼠相比，Rncat 小鼠不同日齡晶狀體組織切片赤道部上皮細胞均有異常增殖現(xiàn)象，其核排列紊亂、呈多層堆積，并向前、后極遷移；亦可在晶狀體深層皮質和核區(qū)見到嗜堿性藍染的晶狀體上皮細胞核，此為晶狀體上皮細胞去核受阻。晶狀體上皮細胞的增殖、分化、去核等過程受到多種生物因素調控，如泛素化、FGF 因子、Jagged-1/Notch［14］信號通路等，但確切機制仍未明了。

綜上所述，隨出生日齡增加，Rncat 小鼠晶狀體組織γS-G489A 突變體表達增加。γS-G489A 突變體可能通過對晶狀體上皮細胞的增殖、分化、去核過程及纖維細胞組織結構產生影響，參與先天性核性白內障的發(fā)生、發(fā)展。