miRNA 在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸發(fā)病機(jī)制中的意義研究進(jìn)展

劉書中 姚思遠(yuǎn) 李政垚 李子全 王牧川 牛潼 高晨郜 王以朋

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸 ( adolescent idiopathic scoliosis，AIS ) 是一種青少年中最為常見的脊柱三維畸形，其整體發(fā)病率約為 1.5%～3.0%，是一種包括冠狀面?zhèn)韧?、矢狀面失平衡和在橫軸位上椎體旋轉(zhuǎn)在內(nèi)的復(fù)雜脊柱三維畸形[1-3]。AIS 常發(fā)生于青春發(fā)育期前后，其發(fā)病及進(jìn)展與基因變異、細(xì)胞及機(jī)體代謝、相關(guān)蛋白表達(dá)及脊柱生物力學(xué)特性等因素密切相關(guān)，其病因?qū)W至今尚未被完全闡明[4-5]。目前，關(guān)于 AIS 病因及發(fā)病機(jī)制的研究逐步開展，從最初的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體組織學(xué)研究，從檢測(cè)激素水平、骨量測(cè)定到近年來開展的基因連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，已經(jīng)取得了一定的研究成果，但截至目前，針對(duì) AIS 發(fā)病機(jī)制的研究結(jié)果與結(jié)論并不一致，故仍難以完全合理地解釋 AIS 的病因及發(fā)病機(jī)制[4-5]。因此，進(jìn)一步深入探索 AIS的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制具有極為重要的意義。

一、miRNA 在 AIS 發(fā)病機(jī)制中的研究基礎(chǔ)

非編碼 RNA ( 微小 RNA、長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，環(huán)狀RNA ) 的水平可以在體內(nèi)某些特定生理?xiàng)l件下發(fā)生特異性變化，可作為生物標(biāo)志物對(duì)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展起到預(yù)測(cè)作用。近年來，微小 RNA ( microRNA，miRNA ) 已被多項(xiàng)研究證實(shí)在某些疾病的進(jìn)程中扮演著重要角色，并具備其獨(dú)特的疾病預(yù)測(cè)性能[6]。首先，miRNA 來源廣泛、易獲取，可從血液、尿液、唾液、淚液或精液等人體分泌物中收集，有望成為一種便捷的非侵入性篩檢手段[7-10]。其次，由于在循環(huán)血液中 miRNAs 通常被包裹在脂質(zhì)顆粒中，并與保護(hù)性蛋白質(zhì)相結(jié)合，這一特性使得 miRNA 可在體循環(huán)狀態(tài)中及體外狀態(tài)下穩(wěn)定存在，不同采集、儲(chǔ)存、處理、分離等條件下均可保持良好的穩(wěn)定性[11]。有學(xué)者證實(shí)，循環(huán)中的 miRNA 與其它種類循環(huán)核酸相比，在血漿和細(xì)胞培養(yǎng)基中均更加穩(wěn)定[12]。再次，研究表明在疾病的早期階段即可以檢測(cè)到特異性 miRNAs 的水平異常，并且大多數(shù) miRNAs 在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的含量具有良好的相關(guān)性[13]。此外，研究證實(shí) miRNA 檢測(cè)在篩檢、診斷、預(yù)測(cè)疾病方面具有較高的敏感性和特異性[14-15]。

近年來，包括 miRNA 在內(nèi)的非編碼 RNA ( non-coding RNA，ncRNA ) 的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展、分級(jí)分期、預(yù)后等密切相關(guān)，參與了多種細(xì)胞重要生物學(xué)行為的調(diào)控，其與 AIS 疾病的關(guān)系也逐漸被揭示，越來越多的研究表明 miRNA 在 AIS 疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用[1,16-17]。此外，由于大多數(shù) ncRNA 是由細(xì)胞分泌的，組織細(xì)胞中的 ncRNA 與外周血中的 ncRNA 具有相同的改變趨勢(shì)，獲取組織或外周血中 ncRNA 所致創(chuàng)傷小，這些特點(diǎn)使 ncRNA 有望成為 AIS 疾病早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及合理治療的新型生化指標(biāo)，并已得到初步研究驗(yàn)證[17-18]。多項(xiàng)研究已表明 miRNA 可通過干預(yù) PTEN / AKT、SMAD3、GAS1 / Akt、RhoC-Akt 等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的成骨分化、髓核細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)降解等多種生物學(xué)行為[1-3]。Chen 等[19]對(duì)維生素 A 缺乏( vitamin A deficiency，VAD ) 后大鼠胚胎 ( 妊娠第 9 日 ) 的ncRNA 表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序 qRT-PCR 檢測(cè)所選 mRNAs、長(zhǎng)鏈ncRNAs、環(huán)狀 RNA ( circRNAs ) 和 miRNAs 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示兩組共檢測(cè)到 749 種 mRNAs、56 種 miRNAs、685 種長(zhǎng)鏈 ncRNAs 和 70 種 circRNAs 表達(dá)水平存在顯著差異，Wnt、PI3K-ATK、FoxO、EGFR 和 mTOR 是脊柱側(cè)凸發(fā)生過程中的重要途徑。Chen 等[20]進(jìn)一步研究了一種特殊的長(zhǎng)鏈 ncRNA ( SULT1C2A ) 在維生素 A 缺乏誘導(dǎo)的側(cè)凸大鼠模型中的作用和機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn) SULT1C2A 可通過 PI3K-ATK 信號(hào)途徑負(fù)性調(diào)節(jié) VAD-側(cè)凸大鼠模型中rno-miR-466c-5p 的表達(dá)，從而增強(qiáng) Foxo4 的表達(dá)，SULT1C2A 可能是脊柱側(cè)凸發(fā)生、發(fā)展的潛在靶點(diǎn)。

miRNA 對(duì)應(yīng)基因已被實(shí)驗(yàn)性地從多種生物中鑒定出來，并且在其它物種中亦存在同源基因，物種間 miRNAs的同源性決定它們是否具有相對(duì)保守的生物學(xué)功能。研究表明人類和小鼠的 miRNA 均位于保守的共線性區(qū)域，已知人類的 miRNA 在小鼠中存在眾多同源體[21-23]。另外，研究者在大鼠 miRNAs 中也鑒定出人類 miRNA 的同源體，在一定程度上表明 miRNA 在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間存在一定的同源性[21-23]。迄今為止，已有多項(xiàng)研究證實(shí)在 AIS的疾病進(jìn)展過程中，miRNAs 也很可能扮演著調(diào)節(jié)者的重要生物學(xué)作用。Li 等[24]在 11 例 AIS 患者和 10 例對(duì)照者中研究了小關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化、組蛋白甲基化改變和細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果顯示隨著年齡的增長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞數(shù)量增加，而小關(guān)節(jié)軟骨中 BCL2 和 COL2A1 的上調(diào)明顯減弱。此外，在 AIS 組中，miR-15a 編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域中組蛋白 3 賴氨酸 9 ( H3K9me3：抑制染色質(zhì)標(biāo)記 ) 的三甲基化降低，而 miR-15a 的表達(dá)亦降低，與對(duì)照組相比，AIS 患者的小關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖增加，可能是由調(diào)節(jié) miR-15a / Bcl2 途徑的 H3K9me3 和 SUV39H1水平升高所致，軟骨細(xì)胞增殖的這種失調(diào)可能導(dǎo)致脊柱脊髓生長(zhǎng)異常，并可能參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]。Ogura 等[25]對(duì) 2142 例 AIS 患者進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究( GWAS )，其中 1105 例表現(xiàn)出臨床進(jìn)展，其余 832 例歸為非進(jìn)展組，研究者使用獨(dú)立隊(duì)列的 AIS 患者 ( 323 例進(jìn)展和 283 例非進(jìn)展患者 ) 進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含有單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism，SNP ) rs1828853 的11q14.1 染色體與 AIS 疾病進(jìn)展密切相關(guān)，表明 rs1828853可能會(huì)通過改變 miR-4300 的表達(dá)來調(diào)控 AIS 的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。

二、miRNA 在 AIS 發(fā)生、發(fā)展中的意義

近年來，非編碼 RNA 在 AIS 脊柱畸形的發(fā)生中所起的重要作用逐漸被揭示并證實(shí)[1-3]。Zhang 等[26]使用miRNA 芯片分析了來自 AIS 患者和對(duì)照組的骨組織切片以及來自這些樣本的原始成骨細(xì)胞中的 miRNA，微陣列分析發(fā)現(xiàn) miR-145-5p ( miR-145 ) 是一個(gè)潛在的上游調(diào)節(jié)因子，miR-145 和 β-catenin mRNA ( CTNNB1 ) 在 AIS 骨組織和原代成骨細(xì)胞中均呈高表達(dá)，在 AIS 中表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，敲除 miR-145 基因可通過下調(diào)活性 β-catenin 的表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄活性來恢復(fù)受損的骨細(xì)胞活性。AIS 患者循環(huán)血 miR-145與血清硬化素、骨橋蛋白和骨保護(hù)素呈顯著負(fù)相關(guān)，并首次證實(shí)異常 miRNA 表達(dá)及其對(duì) AIS 骨細(xì)胞功能的影響可能是導(dǎo)致低骨量的致病原因。間充質(zhì)干細(xì)胞的異常成骨分化與 AIS 的發(fā)病有關(guān)，Zhuang 等[27]對(duì)從 12 例 AIS 患者和 5 例對(duì)照者中分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ( bone marrowmesenchymal stem cell，BM-MSC ) 進(jìn)行了微陣列分析，發(fā)現(xiàn)了 1483 種異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈 ncRNA，其中 718 種表達(dá)下調(diào)，765 種表達(dá)上調(diào)。在正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，lncAIS 與 NF90 相互作用可增加 HOXD8 mRNA 的穩(wěn)定性，從而增強(qiáng) BM-MSCs 中 RUNX2 的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，相反，lncAIS 在 AIS-BM-MSCs 中的下調(diào)不能與 NF90 協(xié)同作用，進(jìn)而破壞 HOXD8 mRNA的穩(wěn)定性，并阻礙 RUNX2 在成骨分化中的轉(zhuǎn)錄[27]。Hui等[28]應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析 AIS 患者 BM-MSC 與健康人BM-MSC 的差異表達(dá) miRNAs 情況，利用生物信息學(xué)分析驗(yàn)證。該研究從 AIS 患者 BM-MSC 中鑒定出 54 個(gè)以前未被發(fā)現(xiàn)的 miRNAs ( 12 種上調(diào)，42 種下調(diào) )，這些 miRNA參與包括 GTPase 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 依賴性轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂、細(xì)胞黏附、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、缺氧反應(yīng)等途徑在內(nèi)的多種生物學(xué)過程，miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-106b-5p、miR-16-5p、miR-93-5p、miR-15a-5p 和 miR-181b-5p 可能在 AIS 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[28]。

AIS 的病因與許多因素有關(guān)，如不對(duì)稱性生長(zhǎng)、神經(jīng)肌肉狀況、骨強(qiáng)度、脊柱生物力學(xué)特性和遺傳因素等。近年來，表觀遺傳因子被認(rèn)為是 AIS 發(fā)病過程中的重要因子，但有關(guān)其分子機(jī)制和致病途徑的研究仍然缺乏[29-30]。miRNAs 是通過調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞途徑參與基因表達(dá)調(diào)控的分子，García-Giménez 等[31]通過 RNA 測(cè)序?qū)?17 例 AIS 患者和 10 名健康對(duì)照者中的循環(huán)血 miRNA 進(jìn)行了分析，然后在 30 例 AIS 患者和 13 名健康對(duì)照中通過 qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn) AIS 患者循環(huán)血中miR-122-5p，miR-27a-5p 和 miR-223-5p 表達(dá)水平更高，上述三種 miRNAs 與 miR-1306-3p ( 作為組合的 miRNA 標(biāo)記 )一起可以將 AIS 患者與對(duì)照組有效鑒別 (AUC= 0.95 )，研究表明循環(huán)血中的 miRNAs 有望用作 AIS 的潛在診斷生物標(biāo)志物[31]。張珂等[32]在研究中發(fā)現(xiàn) miR-516、miR-517、miR-495 在 AIS 患者脊柱側(cè)凸的凹側(cè)與凸側(cè)椎旁肌組織中的表達(dá)存在明顯差異，并且提出 miR-516、miR-517 兩種 miRNAs 的表達(dá)水平與 AIS 患者的發(fā)病年齡和畸形嚴(yán)重程度密切相關(guān)。與上述結(jié)論不完全一致，楊世偉等[33]研究發(fā)現(xiàn) ENST00000602322.1、HIT000067310、ENST00000440778.K、ENST00000414894.K 等多種 ncRNA在 AIS 患者椎旁肌中的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低，但在AIS 患者脊柱側(cè)凸凹側(cè)與凸側(cè)之間上述 ncRNA 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Jiang 等[34]對(duì) 5 例 AIS 患者的椎旁肌組織進(jìn)行了 RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在凹側(cè)和凸側(cè)椎旁肌肉之間存在過氧化物酶體增殖物激活受體 ( PPAR ) 信號(hào)通路和不飽和脂肪酸的生物合成中共 40 種差異表達(dá)的基因。在 PPAR 相關(guān)基因中，ADIPOQ，F(xiàn)ABP4 和 MSTN 在凹側(cè)肌肉組織中呈顯著上調(diào)，而 H19 作為一種對(duì)骨骼肌分化和再生重要的 lncRNA其水平則顯著下調(diào)，因此研究者提出 ADIPOQ 和 H19 的差異表達(dá) AIS 疾病進(jìn)程相關(guān)[34]。Liu 等[35]進(jìn)行了人類 Agilent mRNA 和 lncRNA V3.0 芯片檢測(cè)，以鑒定健康兒童和 AIS患者外周血中 mRNA 和 lncRNA 的表達(dá)模式，研究表明 AIS組和健康對(duì)照組中的 546 種 mRNAs 和 139 種 lncRNAs 之間存在差異性表達(dá)，其中 NR024075 和 ENST00000440778.1分別是上調(diào)和下調(diào)程度最顯著的 lncRNA，在 546 個(gè)差異表達(dá)的 mRNAs 中，AIS 組中有 34 種 mRNA 下調(diào)，而 512種 mRNA 則呈過表達(dá)。此外，研究者還探討了 lncRNA 表達(dá)水平與脊柱側(cè)凸臨床特征之間的相關(guān)性。研究人員發(fā)現(xiàn) TCONS00028768 和 ENST00000440778.1 的表達(dá)水平與脊柱側(cè)凸患者的身高密切相關(guān)，ENST00000602322.1 表達(dá)水平較高患者的發(fā)病年齡也較小，在 Cobb’s 角 > 40° 的脊柱側(cè)凸患者中，ENST00000414894.1 的表達(dá)較低，而ENST00000440778.1 的較高表達(dá)與較高的 Risser 評(píng)分相關(guān)，研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解 miRNAs 在 AIS 發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后中的意義[35]。

三、前景及展望

脊柱側(cè)凸的遺傳和分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制是極為復(fù)雜的，其發(fā)生、發(fā)展過程取決于生物力學(xué)、神經(jīng)肌肉發(fā)育和代謝功能異常等多種因素[36-40]。目前，關(guān)于 AIS 病因及發(fā)病機(jī)制的研究逐步開展，從最初的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體組織學(xué)研究，從檢測(cè)激素水平、骨量測(cè)定到近年來開展的基因連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，已經(jīng)取得了一定的研究基礎(chǔ)和成果，但截至目前仍難以完全合理地縱向解釋 AIS 的病因及發(fā)病機(jī)制。目前，該領(lǐng)域面臨的重要問題包括：( 1 ) 如何從多維度深入理解 AIS 的發(fā)生、發(fā)展過程；( 2 ) 如何有效地將既往的基礎(chǔ)研究成果向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化；( 3 ) 如何將 AIS 的基礎(chǔ)研究、動(dòng)物模型研究和人體樣本研究結(jié)果有機(jī)地結(jié)合起來。

此外，在 AIS 的不同亞型中，miRNA 的表達(dá)情況也有待于進(jìn)一步論證。從基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)有機(jī)結(jié)合的整體視角探索并發(fā)掘 AIS 的發(fā)病機(jī)制，明確基因、環(huán)境因素與臨床表型的相互作用關(guān)系及途徑，進(jìn)而為AIS 早期診斷、病情監(jiān)測(cè)及合理治療提供有力的依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步的病因干預(yù)、防止疾病進(jìn)展具有重要的價(jià)值。發(fā)現(xiàn)并論證其在 AIS 發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵作用是該領(lǐng)域未來基礎(chǔ)研究的重要方向之一。